Summary
Бук заболевания коры инициируется путем подачи деятельность бук масштабного насекомого, которые создают грибковые точки входа в коре. Деревья, которые устойчивы к масштабной насекомого также устойчивых к болезням. Здесь мы представляем протокол мы разработали для скрининга отдельных буковые деревья для бук масштабного сопротивления.
Abstract
Бук кора болезнь (BBD) приводит к высоким уровням начальной смертности, оставив выживших деревьев, которые сильно ослабленных и деформированных. Заболевание инициировали путем подачи деятельность инвазивной бук шкалы насекомых, Cryptococcus fagisuga, который создает точки входа для заражения одного из видов Neonectria гриба. Без масштабного заражения, существует мало возможностей для грибковой инфекции. Использование масштабные яйца искусственно заражают здоровые деревья в значительной степени BBD затрагиваемых стендах показали, что эти деревья были устойчивы к масштабной насекомых части комплекса болезней 1. Здесь мы приводим протокол, который мы разработали, основанный на технике искусственного заражени Хьюстон 2, которые могут быть использованы для скрининга устойчивых масштабных деревьев в этой области и в небольших горшках рассады и трансплантатов. Идентификация масштабных устойчивых деревьев является важным компонентом управления BBD через деревопрограммы улучшения и лесоводственной манипуляции.
Introduction
Бук заболевания коры (BBD) оказало пагубное воздействие на американской бука в Северной Америке с момента введения инвазивного бук масштабного насекомого, Cryptococcus fagisuga, в канадской провинции Новая Шотландия в конце 1890-х годов 3. Этот комплекс насекомых болезнь начинается, когда бук масштаб насекомое вставляет его подачи стилет в кору, создавая небольшие трещины, которые обеспечивают подъезде для инфекции одним из видов Neonectria гриба (Neonectria ditissima или Neonectria faginata). Как грибковые мицелий растет, большие площади ткани могут умереть, в конце концов полностью кольцевание дерево. Ущерб от этой болезни ослабляет дерево, что делает его склонным к щелкая при сильном ветре 4. Уровни смертности в первой волне заболевания были зарегистрированы, чтобы быть выше, чем 50% 5. Выжившие деревья часто сильно деформируется, как язвы образуют снижения стоимости дерева как изделий из древесины.0; Такие деревья имеют склонность к корневой прорастания, что приводит к образованию "буковых зарослях", которые мешают другие, более желаемые виды от установления, уменьшая экономическую и экологическую ценность стенде 6. Хотя бук болезнь кора не может привести к исчезновению американской бука, он изменяет стоять состав и здоровье приводит к уменьшению продуктов питания и среды обитания для диких животных 7,8.
В стендов, пострадавших от BBD в течение многих лет, были зарегистрированы деревья, которые остаются без каких-либо симптомов заболевания. Искусственные испытания прививки показали, что эти деревья устойчивы к масштабной насекомого 2. Без масштабного заражения, существует мало возможностей для Neonectria инфекции, минимизации воздействия гриба. Крупномасштабное смертности в американской бука из-за Neonectria инфекции в отсутствие до масштабного заражения ни разуСообщалось, поэтому устойчивость к бук масштабных насекомых приводит к устойчивости к BBD.
Недавние исследования в области управления BBD была сосредоточена на выявлении, распространения, селекции и хранения американских бука с устойчивостью к бук масштабного насекомого. Генетические исследования показали, что устойчивость к масштабной насекомого наследуется и тщательный отбор и разведение устойчивых деревьев может привести к значительному улучшению жизни одного поколения 9. Этот вывод вызвал усилия государственных и национальных лесных менеджеров в США по созданию региональных семенных плантаций из стойкого американского бука, чтобы обеспечить источник генетически разнообразной BBD устойчивостью семян для восстановления насаждений 10,11. Исследования также показали, что лесоводственной манипуляция генетики стенда путем удаления восприимчивых деревьев и сохранения устойчивых деревьев может привести к стенда улучшение 9,12. </ Р>
Управление BBD через деятельности по улучшению деревьев или путем проведения лесохозяйственных рецепты требуется возможность выбора для и различать буковых масштабных-стойкие и восприимчивы деревьев. Методы, представленные здесь, были адаптированы из метода впервые введена Дэйв Хьюстон, чтобы искусственно привить сеянцы с бук масштабных яиц 1. Способ может быть использован в качестве скрининга для выявления локусов количественных признаков (QTL), связанное с сопротивлением или различать устойчивых и чувствительных горшках проростков или привитыми ramets в генетических исследований. В качестве альтернативы, он может быть использован для скрининга взрослых деревьев в области идентифицировать резистентных деревьев для развития семян фруктовый сад, или удержания в этой области. Восприимчивые деревья могут быть обнаружены и удалены, чтобы минимизировать последствия заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 завод Материал:. Зрелые поле деревья, Комнатные Рассада, или в горшках трансплантатов
- Для полевых испытаний, выберите зрелые здоровые американские буковые деревья, которые не проявляют никаких признаков масштабного заражения или заболевания для тестирования на предмет возможного сопротивления. Заметно восприимчивых деревья будут также должны быть определены для использования в качестве контроля (рис. 1).
- Для тестирования в горшках рассаду или трансплантатов, собирать и прорастают beechnuts, как описано в Кох & Carey, 2004 или трансплантата привоя, как описано в Кэри и др., 2013.
- Вырастить рассаду или трансплантатов в герметичные почвенной смеси поправками с 47 г микроэлементов, 477 г медленное высвобождение удобрений 15N-3.9P-9.9K, 700 г грубой перлита и 75 г сульфата алюминия на 2,8 куб. футов мешок. При необходимости позднее в период вегетации, удобрения растений еженедельные растворимым 17N-1.3P-14.1K при 200 промилле азота.
- В период вегетации, сохранить растения в тени дома. Разрешить растения пойти покоя за пределами осенью до переезда ихс контролируемым хранилища температуры (~ 4 ° С) с ноября по апрель.
2. Сбор Beech Scale яйца
- В BBD-зараженных стенде, осмотрите сильно зараженные деревья (легко определить по их "побелены" внешний вид, фиг.1А) с ручным увеличительное стекло, чтобы подтвердить наличие яиц, как правило, обильные с середины июля до середины августа.
- Используйте кисть, чтобы аккуратно почистить белые восковые скопления масштабных взрослых насекомых, яйца и другого мусора, в пластиковый герметичный сбора один галлон мешок (рис. 1В). Сбор от минимум трех различных деревьев по крайней мере 12 м друг от друга.
- При необходимости хранить яйца в запечатанном сбора мешок на срок до двух недель при температуре 4 ° C. Лента небольшой кусок (2,5 см квадрат) из влажной вспененного полиэтилена к внутренней части сумки, чтобы предотвратить яйца от высыхания.
- Для разделения масштабные яйца (0,15 х 0,25 мм) от взрослых (0,60 мм) и Debriс, построить сито используя короткий кусок 2 'ПВХ трубы и муфты для поддержки квадратный кусок 250 микрон нейлоновую сетку (рис. 2).
- Слейте смесь взрослых, воска, яиц и мусора из мешка сбора на сито и использовать небольшую кисть, чтобы мягко поощрять яйца пройти через сетку в стеклянную чашку Петри ниже. Блюда Пластиковые Петри следует избегать, поскольку они занимают более статического электричества, что делает его трудно двигаться яйца. Яйца до и после просеивания показаны на рисунке 3.
- Очищенные яйца можно хранить в чашке Петри при температуре 4 ° С в течение по крайней мере недели. Для предотвращения яйца от высыхания, лента влажную кусок пенопласта на крышке и печать с парафильмом.
3. Яичные жизнеспособности Анализы
- Чтобы оценить жизнеспособность яиц, используют 10 мл шприц, чтобы нанести тонкий кольцо вазелина по окружности нижней части 60 мм стекл нную чашку Петри (фиг.4А
- Трансфер около 100 яиц в центре кольца, поместите крышку на чашке Петри и печать с парафильмом. Разрешить герметичный чашку Петри, чтобы оставаться в покое при комнатной температуре в течение 2 недель, или 3 недель, если яйца хранили при 4 ° С до начала анализа.
- Появившиеся нимфы будет застрять в вазелина и может быть легко подсчитаны, и пустые яйца легко отличить от невылупившихся яйца по цвету и блеском (рис. 4В). Рассчитать жизнеспособность путем деления числа нимф на сумму пустых яиц плюс остальных полных яиц. Хорошо жизнеспособность должна быть в 75% до 90% вылупившихся диапазоне яйца.
4. Масштаб Сопротивление Скрининг большой зрелый бука в области
- Для количественного теста, отсчитывать 500 яиц с использованием рассекает микроскопом и с помощью небольшого шпателя осторожно посыпать их через центре predampened, с открытыми порами 10 х 15 х 1,3 см прямоугольника вспененного полиэтилена. Ксмочить пену, намочите ее затем выжать столько воды, сколько возможно. Для качественного теста, 500 яйца можно пересчитать, и помещают в небольшую стеклянную пробирку и линией "заполнить", проведенной который может быть использован для измерения дополнительных партий примерно 500 яиц.
- Поместите пенопластовую подкладку на испытательном дерева с яичным стороной против коры. Держите прокладку в месте с веревкой, строки, шпагата или пластиковым покрытием аппаратной проволоки. Пластиковые или металлические основе материал следует использовать, а не природных волокнистых материалов, которые более легко продуваемых дикими животными.
- Линия сверху и с боков из предварительно нарезанной 23 х 30 см кусок паропроницаемостью водонепроницаемый дом обертывание с использованием ацетатного основе силиконового клея и положите его на тест-пена площадку. Нажмите края дома обернуть к дереву, чтобы создать водонепроницаемость. Наведите нейлона шпагат или пластиковым покрытием аппаратного провод вокруг дерева и дома пленкой, чтобы удерживать его на месте в то время как клей схватывается (рис. 5).
- Поместите не менее двухтестовые площадки на каждой тестовой дерева, предпочтительно на противоположных сторонах ствола. На каждом участке, место испытательных набивок, по крайней мере два чувствительных деревьев (с очевидным масштаба заражения) в качестве контроля. До размещения тестовые площадки на контрольных деревьев, удалите все природные червецов или яйца, используя фирма зубной щеткой.
Примечание: Пена колодки с яйцами также могут быть размещены на деревьях с целью разведение масштабных яиц, которые могут быть особенно полезны в тех районах, где уровень заражения низок.
5. Масштаб Сопротивление Скрининг горшках рассады или прививки
- Для тестирования, выберите в горшках деревья с минимальным диаметром 1 см (сателлитов 5 см выше линии почвы), которые достаточно высок, чтобы иметь по крайней мере 2 отдельных тестовых колодки размещены на них. Чернослив небольшие боковые ветви, когда это необходимо, чтобы освободить место для тестовых площадок.
- Используйте рассекает микроскоп, чтобы отсчитывать 150 яиц и брось на предварительно нарезанной и смоченной 2,5 х 7,6 х 1,3 см с открытыми порами сумки изЛене пусковая площадка пены.
- Прикрепите пены клавиатуры саженец с яичным стороной к коре, используя пластиковым покрытием проволоки. Оберните небольшой площади дома обернуть вокруг саженца чуть выше пены и скрепите ацетата основе силикона (см. рис 6А).
- Включить известно восприимчивых семей рассады или трансплантатов в качестве контроля.
6. Сбор данных
Примечание: Приблизительно от 52 до 57 недель после размещения прокладки пены и яйца на тестовых деревьев, данные могут быть собраны. Важно, что это не делается, пока взрослые начали откладывать яйца, так что их способность воспроизводить может быть определена. На некоторых устойчивых деревьев она не является необычным, чтобы увидеть небольшое количество взрослых установить, но с нет воспроизведение происходит.
- Осторожно снимите пенопластовую подкладку и подсчитать количество масштабных взрослых насекомых, установленных на коре использовании объектива рук или увеличительное стекло (10X).
- Когда пена прокладку снимают, это не уncommon для некоторых взрослых и большинстве яичных кластеров, которые будут выдернутыми дерева с пеной (см. рисунок 7). Использование рассекает микроскоп, рассчитывать яичные кластеры и взрослых, которые остались прикреплены к поролоновую подкладку.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Фиг.6 показывает устойчивый рассаду (С) и две чувствительные рассаду (D, E), обладающий различной степени восприимчивости. Пример того, что восприимчивы взрослое дерево выглядит как 57 недель после испытания искусственного заражения был создан показан на рисунке 5В. Когда пена отслаивается от дерева, это не редкость для червецов и их яйца кластеры остаются застрял в пену, как показано на рисунке 7, и именно поэтому важно собирать данные как от дерева и пенные подкладки .
Рисунок 8 иллюстрирует среднее количество взрослых насекомых, установленных на 100 яиц на искусственно зараженных деревьев в двух различных стендов, один в Allegheny National Forest (АНФ) в Пенсильвании, а другой в State Park Ludington (LSP), штат Мичиган. Обе трибуны были заражены BBD и в каждой клети, кластер здорового деревабыл идентифицирован с (LSP Устойчив Устойчив и ANF) и определено, что клональной на основе анализа ДНК (данные не представлены). Клональная кластер BBD-восприимчивых деревьев было также определено в LSP (LSP Подвержены), но в АНФ использовались пять различных восприимчивых деревья (АНФ Подвержены). Во время и между клоновых кластеров, размер менялся в зависимости от DBH начиная от 2.1 до 12.8 дюймов. Рисунок 8 показывает, что, хотя есть много вариаций в числе взрослых, установленных на восприимчивых деревьев, четкие различия обнаруживаются между чувствительными и резистентными деревьев. Был меньше разброс в количестве взрослых в обеих устойчивых кластеров по отношению к восприимчивых деревьев. В устойчивостью кластера ANF, все 12 клонов, которые были протестированы не было взрослых, в то время как в устойчивых кластера LSP некоторые клоны имели небольшое количество взрослых. Однако, не было никакого дублирования в стандартное отклонение от среднего значения устойчивых и восприимчивых деревьев на обоих сайтах.
ВаряТион числа взрослых на клонально связанных деревьев в LSP (LSP Подвержены) больше, чем наблюдается в восприимчивых деревьев ANF (АНФ восприимчивы) несмотря на то, что эти деревья не клональная и генетически отличаются. Жизнеспособность Тесты (данные не показаны), укажите это изменение не связано с большими различиями в жизнеспособности яиц. Изменение, вероятно, из-за обоих генетических и экологических различий и иллюстрирует важность наличия восприимчивых управления для справки на каждом полигоне.
Рисунок 1. Коллекция масштабных яиц от масштаба кишащие американского бука. . Сильно масштаб кишащие Американский бук. Б. Кисть используется чистить червецов взрослых и их яйца в герметичный мешок хранения ниже.
Рисунок 2. Строительство сито, чтобы отделить масштабные яйца от взрослых и других загрязняющих веществ. 4 х 4 дюйма нарезанные квадрат 250 микрон нейлоновой сетке помещается между 4 дюймовый кусок 2 "диаметром трубы ПВХ и муфты для формирования сито .
Рисунок 3. Шкала яйца до (А) и после (B) просеивание. . Смесь масштабных взрослых насекомых, яйца и мусора рассматривается под рассекает микроскопом после сбора из дерева. B. Очищенные яйца, полученный после прохождения через сито.
Рисунок 4. Жизнеспособность тест яйцо. . Кольцо нефти в чашку Петри для улавливания нимф после вылупления. B. Форма I нимфа на праве маркированного вылупившихся яиц. C. Появившиеся яйца светлее и полупрозрачной относительно непрозрачных желтоватых яиц до вылупления.
Рисунок 5. Искусственный заражение зрелого американского бука в области. . Дом обертывание прикреплены ацетата основе силикона для предотвращения избыточной влаги накапливаться на поролоновую подкладку с яйцами под ним. B. Дом обертывание был удален и пусковая площадка пены очищенные назад 52 недели после размещения выявить секКейл колонизации под на этом восприимчивого дерева.
Рисунок 6. Искусственный заражение горшечных американских саженцев бука. А. Пена с яйцами, прикрепленных к стеблю. Б. House обертывание покрытия пены. С. Пена удаляется после 56 недель на сопротивляющейся рассады, Д. восприимчивы рассады, Е. и очень восприимчивы рассады. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 8. Сравнение среднего числа взрослых насекомых, созданных на искусственно зараженных деревьев в двух отдельных стендах. Устойчивые деревья в Allegheny National Forest, штат Пенсильвания (АНФ) и в Ludington State Park, Мичиган (LSP) сравниваются с чувствительными деревьев контроля. Количество деревьев, испытанных в каждой группе перечислены в скобках ниже, и взрослые отсчетов на 100 яиц, применяемых были усреднены во всех деревьев в группе. Бар представляет одно стандартное отклонение от м.EAN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги, необходимые для успеха этого анализа включают выполнения теста на жизнеспособность на яйца и использование восприимчивых управления на каждом участке испытания, и в горшках материалов. Важно также, чтобы использовать более одного тестового прокладки в дерево или рассады. Мы обнаружили, что как в области и в более контролируемых испытаний на горшечные растения, частый источник ошибок может быть отказ площадку. Например, в поле, даже с нашей модификации покрытие Тест-слой с домашним пленкой, чтобы предотвратить избыточную влагу, вода течет вниз стержень может способствовать одну сторону дерева и привести к потере испытательной площадке.
Для того чтобы получить точные результаты, важно, чтобы забить как поверхность дерева, под площадкой и сам пенопластовую подкладку. В дополнение к взрослых и яичные кластеров, только подвижная фаза в масштабе жизненного цикла называется форму I нимфы, также могут быть соблюдены. Эти мобильные нимфы в конечном счетевставить их подачи стилет в коре дерева, став нимфа форма II. Оба типа нимф очень похожи по размеру и внешнему виду к малым, овальной формы яиц, в то время как более крупные взрослые имеют более сферическую форму. Форма Я нимфа отличим от яиц, поскольку он имеет красные глаза и движется, но это движение делает получение точный подсчет очень сложно. Нимфа форма II может легко быть ошибочно приняты за яйца, особенно при записи данных в области с лупой или увеличительное стекло, а не под микроскопом. По этим причинам, мы рекомендуем считая только взрослых и количество яиц кластеров, которые мы нашли дает нам воспроизводимые данные о способности испытуемого дерева для поддержки самоподдерживающейся масштаба заражения. Предыдущая работа показала, что количество взрослых в значительной мере связано с яичным кластера числа 9. Во многих случаях это может быть достаточно, чтобы просто подсчитать взрослых; Однако, мы наблюдали некоторые случаи, когда взрослые способнысоздания на определенных генотипов деревьев, но не производят яйца. Без способности к воспроизводству, масштаб заражения не будет устойчивым на этих деревьев.
Неожиданное крушение этого анализа, когда выступал в области является привлекательность тестовых площадок для медведей. Будущие изменения в протоколе должны быть сосредоточены на использовании материалов, которые могут быть менее привлекательным для медведей или размещения тестовые площадки на разных высотах. Ограничение этого метода тестирования является то, что она не должна быть использована в областях, которые еще не имеют, по крайней мере свет масштабный бук заражения, чтобы избежать риска распространения бука заболевание коры.
Полезность этого метода является то, что он может быть использован для оценки родительский производительность в рамках программы разведения. Для такое потомство испытывает строгие критерии для расширения масштабов сопротивления, как правило, следуют, позволяя только один взрослый и нулевой напримерг кластеры как критерии устойчивости. Используя эти принципы, чтобы выбрать родителей, доля резистентных потомства должно быть примерно 50%, что является значительным улучшением по сравнению с открытым опыляемого семян 15. Однако для целей управления земельными ресурсами может быть желательно использовать менее строгие критерии для сохранения деревьев с деревьев, которые поддерживают низкий уровень червецов могут оставаться относительно здоровым.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность финансирование из Лесного США мониторингу служба по лесному хозяйству оценки по охране здоровья и специальной технологии программ развития, которые оказали поддержку разработки, изменения и применения протокола, описанного здесь, чтобы определить деревьев, которые устойчивы и восприимчивы к бук масштабного насекомого. Мы также благодарны Holden Дендрарий Киртланда, Огайо, за их постоянную партнерства и поддержку нашего американского бука программы скрининга сопротивления.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nylon Mesh Sheet, 250 micron |  Small Parts |
CMN-0250-D | Mesh opening size: 250 microns square, % of open area: 34, thread diameter: 180 micron, width: 24”, Length: 12”, Package quantity: 1 |
| Tyvek Home Wrap | DuPont |
D1349991 | 9 ft x 150 ft roll, can ask for it to be cut in half. |
| Polyethylene foam, ½” thick | Columbus Foam Products |
2 ft x 50 ft roll | |
| MetroMix 510 | Sun Gro Horticulture |
2.8 cu. ft. bark, peat moss, vermiculite, bark ash, starter nutrient charge (with Gypsum), slow release nitrogen and dolomitic limestone. | |
| Osmocote Plus 15-9-12 | Everris |
E903206 | Standard 3-4 month release |
| Sight Savers 10X | Bausch & Lomb |
813434 | 10X magnification illuminated coddington |
| Nikon Mini Field Stereoscope | Nikon |
7314 | 20X magnification |
| Silicone II clear | GE |
159538 | 2.9 oz clear window & door caulk |
References
- Houston, D. R. A technique to artificially infest beech bark with the scale, Cryptococcus fagisuga (Lindinger). U.S. Forest Service. , Northeastern Forest Experiment Station. Broomhall, PA. (1982).
- Houston, D. R. American beech resistance to Cryptococcus fagisuga. Proceeding, IUFRO beech bark disease working party conference. , U.S. Department of Agriculture, Forest Service, Northeastern Forest Experiment Station. Washington, D.C. 38-42 (1983).
- Ehrlich, J. The beech bark disease: a nectria disease of Fagus, following Cryptococcus fagi. 10, 593-692 (1934).
- Papaik, M. J., Canham, C. D., Latty, E. F., Woods, K. D. Effects of an introduced pathogen on resistance to natural disturbance: beech bark disease and withdrow. 35, 1832-1843 (2005).
- Miller-Weeks, M. Current status of beech bark disease in New England and New York. Proceeding, IUFRO beech bark disease working party conference. , U.S. Department of Agriculture, Forest Service, Northeastern Forest Experiment Station. Washington, D.C. 21-23 (1983).
- Houston, D. R. Beech bark disease: The aftermath forests are structured for a new outbreak. J. For. 73, 660-663 (1975).
- Twery, M. J., Patterson, W. A. Variations in beech bark disease and its effects on species composition and structure of northern hardwood stands in central New. 14, 565-574 (1984).
- Jakubus, W. J., McLaughlin, C. R., Jensen, P. G., McNulty, S. A., et al. Alternate year beechnut production and its influence on bear and marten populations. Beech Bark Disease: Proceedings of the Beech Bark Disease Symposium. Evans, C. A., et al. , U.S. Forest Service, Northern Research Station. Newtown Square, PA. 79-87 (2005).
- Koch, J. L., Carey, D. W., Mason, M. E., Nelson, C. D. Assessment of beech scale resistance in full- and half-sib families. Can. J. For. Res. 40, 265-272 (2010).
- Koch, J. L. Beech bark disease: The oldest “new” threat to American beech in the United States. Outlooks Pest Manag. 21, 64-68 (2010).
- Koch, J. L., Mason, M. E., Carey, D. W., et al. Screening for resistance to beech bark disease: improvements and results from seedlings and grafted field selections. Proceedings of the 4th International Workshop on Genetics of Host-Parasite Interactions in Forestry. Palmieri, K., et al. , U.S. Forest Service, Pacific Southwest Research Station. Albany, CA. (2012).
- Leak, W. B. Fifty year impacts of the beech bark disease in the Bartlett Experimental Forest, New Hampshire. Northern J. Appl. For. 23, 141-143 (2006).
- Koch, J. L., Carey, D. W., et al. Controlled cross-pollinations with American beech trees that are resistant to beech bark disease. Proceedings of the 14th Central Hardwood Forest Conference. Yaussy, D. A., et al. , U.S. Forest Service, Northeastern Research Station. 358-364 (2004).
- Carey, D. W., Mason, M. E., Bloese, P., Koch, J. L. Hot callusing for propagation of American beech by grafting. HortSci. 48, 620-624 (2013).
- Koch, J. L., Carey, W. W., et al. The genetics of resistance of American beech to beech bark disease: knowledge through 2004. Beech Bark Disease: Proceedings of the Beech Bark Disease Symposium. Evans, C. A., et al. , U.S. Forest Service, Northern Research Station. Newtown Square, PA. 98-105 (2005).
