Deux-Photon<em> In vivo</em> Imagerie des épines dendritiques dans le cortex de souris utilisant un crâne-Diluée Préparation
Summary
Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.
Abstract
Dans le cortex des mammifères, les neurones forment des réseaux très complexes et l'échange d'informations au niveau des synapses. Changements dans la force synaptique, ainsi que l'ajout / suppression de synapses, se produisent d'une manière dépendant de l'expérience, fournissant la base structurelle de la plasticité neuronale. Comme composants post-synaptiques des synapses excitateurs plus dans le cortex, épines dendritiques sont considérées comme un bon indicateur de synapses. Prendre avantages de la génétique de la souris et des techniques de marquage par fluorescence, des neurones et de leurs structures synaptiques peuvent être marqués dans le cerveau intact. Ici, nous introduisons un protocole d'imagerie transcrânienne utilisant deux photons microscopie à balayage laser à suivre épines dendritiques post-synaptiques marquées par fluorescence dans le temps in vivo. Ce protocole utilise une préparation-crâne amincie, ce qui maintient intact le crâne et évite les effets inflammatoires causées par l'exposition des méninges et le cortex. Par conséquent, les images peuvent être acquises immédiatement après surgery est effectuée. La procédure expérimentale peut être effectuée de manière répétitive au cours de différents intervalles de temps allant de quelques heures à plusieurs années. L'application de cette préparation peut également être étendu pour étudier différentes régions et couches corticales, ainsi que d'autres types de cellules, dans des conditions physiologiques et pathologiques.
Introduction
Le cortex des mammifères participe à de nombreuses fonctions du cerveau, de la perception sensorielle et contrôle des déplacements à l'abstrait traitement de l'information et de la cognition. Diverses fonctions corticales s'appuient sur différents circuits neuronaux, qui sont constitués de différents types de neurones qui communiquent et échangent des informations au niveau des synapses individuelles. La structure et la fonction des synapses sont constamment modifiés en réponse à des expériences et des pathologies. Dans le cerveau mature, la plasticité synaptique prend la forme de deux changements de résistance et ajout / suppression de synapses, jouant un rôle important dans la formation et l'entretien d'un circuit neuronal fonctionnel. Épines dendritiques sont les composantes post-synaptiques de la plupart des synapses excitatrices dans le cerveau des mammifères. Le chiffre d'affaires constant et les changements morphologiques des épines sont censées servir comme un bon indicateur de modifications dans les connexions synaptiques 1-7.
Biphotonique à balayage laser microscopie offre pénétration profonde à travers épaisses, préparations opaques et faible phototoxicité, qui le rend approprié pour l'imagerie en direct dans le cerveau intact 8. En combinaison avec un marquage fluorescent, l'imagerie à deux photons fournit un outil puissant pour jeter un regard dans le cerveau vivant et suivez réorganisation structurelle au niveau des synapses individuelles à haute résolution spatiale et temporelle. Divers procédés ont été utilisés pour préparer des souris pour l'imagerie en temps réel 9-13. Ici, nous décrivons une préparation-crâne amincie de l'imagerie in vivo à deux photons pour étudier la plasticité structurale des épines dendritiques post-synaptiques dans le cortex de la souris. En utilisant cette approche, nos études récentes ont représenté une image dynamique de l'évolution de la colonne vertébrale dendritiques en réponse à moteur compétence apprentissage Avec la disponibilité croissante des animaux transgéniques avec des sous-ensembles de neurones marqués par fluorescence et le développement rapide des techniques in vivo dans l'étiquetage, les procédures similaires à ceux décrits ici peuvent également être appliqués à enquêted'autres types de cellules et de te régions corticales, combinés à d'autres manipulations, ainsi que utilisé dans les modèles de la maladie 16-23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour obtenir une préparation-de crâne amincie succès, plusieurs étapes de ce protocole sont cruciales. 1) L'épaisseur de la boîte crânienne. L'os crânien a une structure en sandwich, avec deux couches de haute densité osseuse compacte et une couche intermédiaire de faible densité de l'os spongieux. Bien que le micro-foret à haute vitesse est adapté pour enlever les couches externes de l'os compact et l'os spongieux, la lame de microchirurgie est idéal pour l'amincissement de la couc…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions James Perna pour l'illustration graphique. Ce travail a été financé par des subventions de l'Institut national de la santé mentale à YZ
Materials
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-034-10 | Mixed with xylazine for anesthesia |
| Xylazine | Lloyd laboratories | 139-236 | Mixed with ketamine for anesthesia |
| Saline | Hospira | 0409-7983-09 | 0.9% NaCl for injection and imaging |
| Razor blades | Electron microscopy sciences | 72000 | Double-edge stainless steel razor blades |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | Sterile alcohol prep pads |
| Eye ointment | Henry Schein | 102-9470 | Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant |
| High-speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area |
| Micro drill steel burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | 1.4 mm diameter |
| Microsurgical blade | Surgistar | 6961 | The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone |
| Cyanoacrylate glue | Fisher Scientific | NC9062131 | Fix the head plate onto the skull |
| Suture | Havard Apparatus | 510461 | Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| CCD camera | Infinity | ||
| Two-photon microscope | Prairie Technologies | Ultima IV | |
| 10X objective | Olympus | NA 0.30, air | |
| 60X objective | Olympus | NA 1.1, IR permeable, water immersion | |
| Ti-sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP |
Referencias
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