Amplification linéaire d'une PCR - Localisation des éléments génétiques et caractérisation de Unknown ADN flanquant
Summary
Linéaire amplification médiée (LAM)-PCR est une méthode mise au point pour identifier la position exacte de l'intégration des vecteurs viraux dans le génome. La technique a évolué pour devenir la meilleure méthode pour étudier la dynamique clonale chez les patients de thérapie génique, de la biosécurité de nouvelles technologies de vecteur, la diversité des lymphocytes T, des modèles de cellules souches du cancer, etc
Abstract
Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3’- and 5’- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.
Introduction
Linéaire d'amplification médiée par PCR (LAM-PCR) permet d'identifier et de caractériser inconnu ADN flanquant adjacente à ADN connu de toute origine. Plus précisément, LAM-PCR a été développée pour localiser les sites d'intégration de vecteurs viraux (IS) dans le génome hôte 1,2. Les éléments génétiques comme les rétrovirus ou transposons intégrer leur génome dans le génome de l'hôte dans un (semi-) de manière aléatoire 3-6. Dans de nombreux cas, il est décisif de savoir exactement l'endroit où ces vecteurs intégrés. LAM-PCR a été prouvé pour être supérieur à d'autres techniques comme la ligature et d'une PCR 7 et ses variantes ou PCR inverse 8. La sensibilité et la robustesse de cette méthode résultent d'une pré-amplification initiale des jonctions vecteur du génome et la sélection magnétique de produits de PCR amplifiés. Comme les autres méthodes mentionnées, LAM-PCR repose sur l'utilisation d'enzymes de restriction, l'introduction d'un biais dans la capacité de récupération de l'IS 9-11. Ainsi,seulement un sous-ensemble du répertoire IS (la integrome) peut être détecté dans une réaction. Ce biais est minimisé par l'analyse en parallèle d'un échantillon donné en utilisant des combinaisons optimales des enzymes de restriction 9. Récemment, une variante de la technologie dite non restrictive LAM-PCR (nrLAM-PCR) a été développé qui contourne l'utilisation d'enzymes de restriction et permet impartiale analyse du génome d'un échantillon dans une seule réaction 9,12.
Dans le passé, LAM-PCR a été utilisée pour identifier le responsable rétrovirale donne lieu à la leucémie chez quelques patients dans les essais cliniques de thérapie génique 13-15. Depuis lors, LAM-PCR a été conçu pour identifier IS d'autres vecteurs d'intégration (vecteurs lentiviraux, transposons) et aussi d'identifier des modèles d'intégration d'intégration passivement vecteurs comme vecteurs adéno-associés (AAV) ou vecteurs lentiviraux intégrase défectueux (IDLV) 16 -21. Applications de LAM-PCR sont largement répandus: traditionnellement, la technique est largement utilisée pour étudier la composition clonale de cellules de gènes modifiés chez les patients qui ont subi la thérapie génique ou pour évaluer la biosécurité des nouveaux systèmes de vecteurs par démêler leur comportement d'intégration 15,16,22-24. Récemment, LAM-PCR a permis de déterminer la spécificité et de l'activité hors cible des nucléases de luxe par un essai de piégeage IDLV 25.
En outre, LAM-PCR permet de suivre facilement le sort d'une cellule transduction au fil du temps dans un organisme. Ceci permet d'identifier les proto-oncogènes ainsi que des gènes suppresseurs de tumeurs et également pour étudier l'hématopoïèse ou de la tige de biologie des cellules cancéreuses 26-28. Last but not least, LAM-PCR a été adapté pour étudier la diversité de récepteur des cellules T chez l'homme (29 et données non publiées).
La puissance intrinsèque de la technologie est renforcée par le procédé de liaison à des technologies de séquençage profondes qui permettent la caractérisation des millions d'ADN flanquant inconnu avec un seul nucléotide résolution dans les génomes entiers. Dans le protocole suivant, nous décrivons étape par étape l'amplification et l'identification de l'ADN flanquant inconnu exemplairement pour identifier vecteur lentiviral EST. Les oligonucleotides utilisés dans le protocole sont répertoriés dans le tableau 1. Extrait d'ADN ou d'ADNc de n'importe quelle source peuvent être utilisés en tant que matrice d'ADN pour LAM-PCR et PCR-nrLAM.
Protocol
Representative Results
Discussion
La technique LAM-PCR permet d'identifier des séquences d'ADN inconnues qui flanquent une région d'ADN connue. En raison de la sensibilité élevée résultant de pré-amplification de la jonction avec l'hybridation des amorces spécifiques de la séquence d'ADN connue, il est possible d'amplifier et de détecter même des jonctions rares jusqu'au niveau de la cellule unique. A l'inverse, dans une situation polyclonal LAM-PCR est capable d'amplifier les milliers de différentes jonct…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230, grant of the Tumor Center Heidelberg/Mannheim), by the Bundesministerium für Bildung und Forschung (iGene), by the VIth + VIIth Framework Programs of the European Commission (CONSERT, CLINIGENE and PERSIST). We thank Ina Kutschera for demonstrating the protocol technique in the video.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
| PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
| dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
| Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
| PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1 % wt/vol BSA |
| 6M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
| Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
| EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
| Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
| Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
| Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
| Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
| CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
| Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
| TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
| Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
| 100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
| 20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96 well plates |
| Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
| PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
| TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
| Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
| PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
| Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
| Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
| Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
Referencias
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