سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف
Summary
هنا، نحن تصف منهجية لإجراء سيرنا المستهدفة "ubiquitome" الشاشة لتحديد اليوبيكويتين الرواية والمنظمين مثل اليوبيكويتين الاستجابة بوساطة HIF1A الخلوية لنقص الأكسجة. وهذا يمكن أن تتكيف مع أي مسار بيولوجي حيث قراءة قوية من النشاط الصحفي هو متاح.
Abstract
تعديل آخر متعدية من البروتينات مع اليوبيكويتين وتشبه جزيئات اليوبيكويتين (UBLs) والناشئة باعتبارها شبكة الإشارات الخلوية الحيوية التي تنظم مسارات بيولوجية متنوعة بما في ذلك الاستجابة نقص الأكسجة، proteostasis، استجابة الحمض النووي من التلف والنسخ. لفهم أفضل لكيفية UBLs تنظيم مسارات ذات الصلة إلى الأمراض التي تصيب البشر، قمنا بتجميع سيرنا الإنسان "ubiquitome" مكتبة تتكون من 1،186 سيرنا حمامات دوبلكس تستهدف جميع المعروفة ومكونات نظام مسارات أسامة بن لادن توقع. هذه المكتبة يمكن فحص ضد مجموعة من خطوط الخلايا معربا عن صحفيين من المسارات البيولوجية المتنوعة لتحديد المكونات التي تعمل أسامة بن لادن كما المنظمين إيجابية أو سلبية للمسار في السؤال. هنا، نحن تصف بروتوكول الاستفادة من هذه المكتبة لتحديد ubiquitome المنظمين للاستجابة بوساطة HIF1A الخلوية لنقص الأكسجين باستخدام مراسل luciferase القائم على النسخ. مرحلة التطوير الأولي مقايسةيتم تنفيذها لوضع معايير الفرز مناسبة من خط الخلية قبل تنفيذ الشاشة في ثلاث مراحل: الابتدائي والثانوي والجامعي الفحص / deconvolution. استخدام استهدفت أكثر من مكتبات الجينوم سيرنا كله تزداد شعبية لأنها تتيح ميزة الإبلاغ فقط على أعضاء المسار الذي المحققين هي الأكثر اهتماما. على الرغم من القيود المتأصلة في سيرنا الفرز، على وجه الخصوص، ايجابيات كاذبة الناجمة عن سيرنا خارج الهدف آثار، وتحديد المنظمين رواية حقيقية من المسارات في مسألة تفوق أوجه القصور هذه، والتي يمكن التغلب عليها عن طريق إجراء سلسلة من التجارب التي تضطلع التحكم بعناية.
Introduction
تعديل البروتينات مع اليوبيكويتين وتشبه جزيئات اليوبيكويتين (UBLs) يمثل نظام البيوكيميائية توسعية الذي ينظم مسارات بيولوجية متنوعة واستجابات التوتر. المرفق التساهمية من UBLs إلى البروتينات المستهدفة يمكن أن يكون لها نتائج مختلفة تنظم الاستقرار والتوطين، وظيفة أو interactome الركيزة 1. أنشئت الخطوات الأنزيمية الكامنة التعديل الأول لأسامة بن لادن اليوبيكويتين، ويخدم الآن كنموذج للتعديل مع معظم UBLs، بما في ذلك السومو، NEDD8، ISG15 وFAT10. لتعديل لتحدث، ويتم تنشيط مجموعة الكربوكسيل من diglycine عزر أسامة بن لادن أول من انزيم تفعيل E1 لتشكيل ثيول عالية الطاقة التي يتم نقلها إلى السيستين موقع نشط من انزيم التصريف E2. ثم يتفاعل مع E2-E3 يغاز الركيزة ملزمة للتوسط نقل أسامة بن لادن على (عادة) بقايا يسين الهدف خلق سلسلة متفرعة (isopeptide) الربط 2. يمكن أن يحدث جولات متعاقبة من التعديل لبناء سلاسل isopeptide على الركيزة، والتي لاليوبيكويتين يمكن أن يحدث من خلال أي من سبعة lysines لها، أو من خلال-N محطة ميثيونين لخلق سلاسل اليوبيكويتين الخطية. هذه التعديلات تشكل طبولوجيا منفصلة مع أغراض متنوعة مثل إنشاء الزخارف التفاعل جديدة واستهداف البروتينات للتدهور قبل إزالة أسامة بن لادن بواسطة البروتياز المتخصصة. في حالة اليوبيكويتين هناك اثنين من الانزيمات E1، E2 30-40 الانزيمات التصريف، 600 E3 على الأقل ونحو 100 ligases الانزيمات deubiquitylating (يصف). في حين أن مسارات هي أقل توسعية لأخرى 10 أو نحو ذلك UBLs، وتعقد ubiquitome الشاملة يتيح التنوع الهائل في النتيجة البيولوجية للتعديل خاصة أسامة بن لادن. ومع ذلك، في حين تم إحراز تقدم كبير في علم الأحياء أسامة بن لادن، لا تزال الأدوار الخلوية الدقيقة للأغلبية هذه المكونات ubiquitome غير معروف.
استخدام الباحث قصيرةوقد برزت erfering حمض النووي الريبي (الرناوات siRNAs) كأداة قوية في مجال علم الوراثة العكسية ويرجع ذلك إلى قدرة الرناوات siRNAs خصيصا لاستهداف mRNAs والخلوية للتدمير، والسماح للدور الجينات الفردية لفحصها في سياقات البيولوجية المختلفة 3. وقد استخدمت شاشات الجينوم لتحديد والتحقق من صحة المنظمين جديدة من العديد من العمليات الخلوية، وخلقت ثروة من البيانات المفيدة في متناول المجتمع العلمي على نطاق أوسع. ومع ذلك، في حين أثبتت شاشات الجينوم مفيدة للغاية، وشاشات استهدفت تزداد شعبية لأنها أرخص وأسرع وأقل تنطوي على إدارة البيانات والتقرير فقط على أعضاء الجينوم التي المحقق هو الأكثر اهتماما. لذلك، من أجل فهم أفضل التي تشارك العمليات الخلوية أسامة بن لادن مكونات الأسرة في، قمنا بتجميع مكتبة سيرنا الإنسان تستهدف جميع المعروفة ومكونات ubiquitome توقع. ويشمل هذا UBLs، E1 الانزيمات تفعيل، E2 التصريفالإنزيمات، ligases E3، مجال ملزم اليوبيكويتين (UBD) التي تحتوي على البروتينات ويصف. هذه المكتبة يمكن استخدامها لشاشة ضد طائفة واسعة من خطوط الخلايا مراسل من المشاكل البيولوجية متميزة، مما يتيح تحديد موضوعية حول مكونات أسامة بن لادن الرواية التي تحكم هذه الممرات.
يصف بروتوكول التالية كيفية إجراء صارم سيرنا المستهدفة ubiquitome الشاشة لتحديد المنظمين رواية من الاستجابة تعتمد على HIF1A لنقص الأكسجة. تحت التوتر الأكسجين العادي، HIF1A يخضع لprolyl الهيدروكسيل أن يؤدي إلى الاعتراف بها والمستهدفة للتدهور من قبل فون هيبل لينداو (VHL) E3 يغاز معقدة 4. نقص الأكسجة يمنع الهيدروكسيل prolyl مما يؤدي إلى استقرار HIF1A واللاحقة ملزمة لعناصر استجابة نقص الأكسجة (HRES) لدفع التعبير الجيني. هنا، نحن تصف الشاشة باستخدام خلايا عظمية U20S معربا عن ستابلي يراعة luciferase تحت سيطرة ثلاث نسخ جنبا إلى جنب من هايpoxia استجابة عنصر (الخلايا U20S-تعليم حقوق الإنسان) 5. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لأي مسار بيولوجي إذا قوي للقراءة من النشاط الصحفي هو تحقيق ويمكن أن يقترن مع الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أثبت استخدام شاشات سيرنا على نطاق الجينوم في خلايا الثدييات أن تكون قيمة للغاية في تحديد المنظمين رواية من المسارات البيولوجية متميزة. هنا، ونحن قد وصفت استخدام شاشة ubiquitome سيرنا المستهدفة لتحديد المنظمين للاستجابة بوساطة HIF1A الخلوية لنقص الأكسجة. شاشات المستهد?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل ويلكوم ترست وجلاكسو سميث كلاين (GSK) والمعهد الاسكتلندي للتشوير الخليوي (وهي الآن جزء من الفسفرة البروتين MRC وحدة Ubiquitylation).
Materials
| Automated Liquid Dispenser | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| Automated cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html |
| Hypoxia Workstation | Ruskin | In vivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 |
| Automated Cell Dispenser | Thermo Scientific | Matrix Wellmate | http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11 |
| Plate Shaker | Heidolph | Titramax 1000 | http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/ |
| Luminometer | Perkin Elmer | Envision 2104 Multilabel Reader | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers |
| White Walled Assay Plate | Greiner Bio One | 655083 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ |
| Clear Plate Film | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| Name of the Reagent | |||
| siRNA library | Thermo Scientific | On-Target Plus | http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ |
| Transfection reagent | Invitrogen | Lipofectamine RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| Reduced Serum Medium | Invitrogen | Optimem | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| Tryspin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
Referencias
- Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458, 422-429 (2009).
- Schulman, B. A., Harper, J. W. Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 319-331 (2009).
- Siomi, H., Siomi, M. C. On the road to reading the RNA-interference code. Nature. 457, 396-404 (2009).
- Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Mol Cell. 30, 393-402 (2008).
- Melvin, A., Mudie, S., Rocha, S. The chromatin remodeler ISWI regulates the cellular response to hypoxia: role of FIH. Mol Biol Cell. 22, 4171-4181 (2011).
- Bhinder, B., Djaballah, H. A simple method for analyzing actives in random RNAi screens: introducing the "H Score" for hit nomination & gene prioritization. Comb Chem High Throughput Screen. 15, 686-704 (2012).
- Bett, J. S., et al. The P-body component USP52/PAN2 is a novel regulator of HIF1A mRNA stability. Biochem J. 451, 185-194 (2013).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat Methods. 6, 569-575 (2009).
- Stagg, H. R., et al. The TRC8 E3 ligase ubiquitinates MHC class I molecules before dislocation from the ER. J Cell Biol. 186, 685-692 (2009).
- Zhang, Y., et al. RNF146 is a poly(ADP-ribose)-directed E3 ligase that regulates axin degradation and Wnt signalling. Nat Cell Biol. 13, 623-629 (2011).
- Jackson, A. L., et al. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Birmingham, A., et al. 3′ UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nat Methods. 3, 199-204 (2006).
- . Whither RNAi. Nat Cell Biol. 5, 489-490 (2003).
