The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.
골격 근육 때문에, 기능 세포, 분자, 병리학 적 평가에서 최적의 결과를 얻기 위해 조직 수집을위한 특정 프로토콜을 필요로 그 구조와 기능의 고유 한 조직이다. 선천성 근육 질환에 대한 골격 근육을 평가할 때 인해 선천성 근육 질환 및 이러한 기능의 인식을 방해하는 고정의 가능성을 볼 몇 가지 병리학 적 이상 소견의 미묘함에, 냉동 근육의 병적 인 평가는 고정 근육에 바람직하다. 다른 조직을 동결 할 때 일반적으로 사용하지 않는 조직 학적 검사에 대한 골격 근육을 동결 할 때 또한 근육에 심한 동결 아티팩트를 생성 할 수있는 잠재력이 특정주의가 필요합니다. 이 필사본 최적 골격근 형태를 보존하기 위해 액체 질소로 냉각 한 이소 펜탄 (2 – 메틸 부탄)를 사용하여 골격근의 급속 냉동을위한 프로토콜을 설명한다. 이 절차는 또한 F에 효과적이다유전자 또는 단백질 발현 연구를위한 조직을 reezing. 또한, 우리는 수집하는 데 필요한 최소의 노력에 초점을도 (1) 단 하나 섬유의 기능 연구 (2) 근원 세포의 세포 배양을위한 조직의 단기 부상자 명단에 대한 선호하는 방법을 설명하는 광범위한 절차로 우리의 동결 프로토콜을 통합 한 조직과 이러한 연구를 완료하기 위해 전문 연구 또는 참고 실험실에 수송한다. 전반적으로,이 원고는 신선한 조직이 효과적으로 표현형 연구 다양한 분배 될 수있는 방법의 개요를 제공함으로써 선천성 근육 질환과 관련된 병리학 적 연구에 대한 표준 작업 절차 (SOP에)를 제공한다.
Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which can present a number of challenges when evaluating its pathology. While it is sufficient, and often even optimal, to evaluate most tissues following formalin fixation and paraffin embedding, this process leads to the production of cell shrinkage artifacts that impair the evaluation of critical phenotypes in congenital muscle disease (including myofiber size and shape). Additionally, frozen muscle is required when performing many histochemical stains (including the reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), cytochrome oxidase (COX), succinate dehyrogenase (SDH), adenosine triphosphatase (ATPase), and Oil Red O stains) that are essential for the detection of specific pathological abnormalities required to diagnose a variety of congenital myopathies, mitochondrial myopathies, and storage diseases. Many antibodies and molecular tools used to characterize muscle morphology and function have consequently been developed and optimized only for frozen tissue, which further limits the usefulness of fixed tissue preparations in studies of skeletal muscle biology. As a result, it has become standard practice to freeze skeletal muscle specimens for most clinical and research indications in the field of congenital muscle disease, despite the technical challenges that appropriate freezing might pose.
The freezing of skeletal muscle can be technically challenging due to the high likelihood of ice crystal formation within myofibers when an inappropriate freezing protocol is followed1. In most cases, freezing artifacts are encountered when the water content of the tissue is too high or when the freezing process is too slow. The water content of tissue can be accidentally increased by immersion in fluid, such as transport of the muscle in saline; or freezing can be compromised if the tissue has been entirely immersed in OCT. Both of these procedures can lead to catastrophic freezing artifacts in muscle tissue. Additionally, a number of small missteps in the freezing process may cause slow freezing or accidental thawing of samples after appropriate freezing, and these issues can similarly complicate pathological evaluation.
As new models and treatments for skeletal muscle disease are developed, it will become increasingly useful to use standard operating procedures (SOPs) to evaluate skeletal muscle phenotypes and treatment efficacy. This is particularly important for the pathological evaluation of congenital muscle diseases, as the recognition of subtle phenotypes seen in many of these disorders can be impaired by improper tissue preparation. This report represents an effort by a Congenital Muscle Disease Consortium to establish a skeletal muscle freezing SOP for the study of congenital muscle disease models.
The protocol presented here describes a strategy used in our clinical and research labs to optimize assessment of frozen muscle pathology, while also being suitable for a variety of protein-based and genetic studies. Specific strategies to prepare skeletal muscle specimens for electron microscopy are also presented. Additionally, as single fiber functional testing of frozen tissue is possible2,3, experts in these techniques have provided details on optimal tissue handling protocols. Unfortunately, the isolation of myoblast cell lines cannot be effectively performed on pre-frozen tissue, so a strategy is presented herein for the short-term storage and transport of muscle tissue for myoblast culture establishment at outside laboratories. Overall, the methods described here provide guidelines for the appropriate processing of muscle tissue for a variety of pathological, functional, molecular and cellular studies, regardless of the on-site capabilities of a given laboratory.
골격근은 구조적으로 그리고 기능적으로 독특한 조직이며, 전문화 준비 절차는 구조적 및 기능적 파라미터의 최적의 평가를 허용 할 필요가있다. 다양한 조직은 일반적으로 임상과 연구 상황에서 병리학 연구에 고정되는 반면, 비 근육 조직에 대한 동결 프로토콜은 일반적으로 동결하기 전에 OCT에서 조직의 몰입을 포함한다. 도 3에 도시 된 바와 같이, 이러한 프로토콜은 골격근의 병리학 적 평가를 위해 적합하지 아직이 일반적으로 발생하는 오류라고 기재 프로토콜 충분히 유사하다. 이 논문의 목적은이 같은 문제를 방지하기 위해 근육의 적절한 처리를위한 간단한 프로토콜을 제공하는 것입니다. 조언도 경우에 외부의 핵심 연구소로 고품질 데이터의 수집을 용이하게하기위한 노력의 일환으로 오프 사이트 생리 학적 및 세포 연구에 대한 근육의 적절한 처리에 컴파일 된 갔지다시 현장 연구는 바람직하거나 할 수 없습니다.
이 프로토콜에 명시된 바와 같이, 병리학 적 연구에 대한 근육의 적절한 처리에 절대적으로 필수적인 요소는 조직의 수분 함량을 최소화하는 근육이 고정되는 온도를 감소하고, 동결이 달성되는 속도를 증가 있습니다. 조직 또는 (액체 질소로 발생 불충분 한 온도 또는 냉동 에이전트와 조직 사이의 직접 접촉의 부족에 의해 생성) 냉동 과정의 과도한 속도 저하 내의 과도한 수분은 병리학 적 분석에 악영향을 줄 수 유물을 동결로 이어질 것입니다. OCT를 조직의 수분의 추가 소스를 제공, 많은 실험실 내장 기판으로 검 트라가 칸트와 같은 다른 접착제를 사용합니다. 심지어 동결이 적절하게 수행되는 경우에, 치료는 RT 용기 또는 악기와 접촉을 통해 이후에 실수로 해동 표본을 방지하기 위해주의해야한다.따라서, 성공적인 냉동 공정은 사용되는 모든기구와 용기의 사전 냉각을 포함 계획도를 필요로한다. 냉동 아티팩트가 발생하는 경우, 대부분의 병리학 적 평가에 충분한 조직의 복구를 위해 여기에 설명 된 방법이있다. 그러나,이 동결 / 해동 사이클은 완벽 조직학을 제공하고 (다시 동결 조직에 필요한 시간에 부가하여) 조직의 다른 분자 또는 효소 연구를 저해 할 가능성이 있으므로 적절한 초기 냉동 방법을 사용하는 것이 크게 바람직하지 . 동결 이슈가 미리 고정 된 조직에서 발견 될 경우에, 그러나, 본 명세서에 기재된 기술은 매우 유용 할 수있다.
EM 전에 조직 컬렉션에 대한 계획이 필요 특정 기술 과제를 제공 할 수 있습니다에 대한 조직의 고정 및 처리. EM위한 표본을 수집 가장 일반적인 오류 glutaraldehyd 너무 두꺼운 조직 단편의 사용을 포함전자 침투. 글루 타르 알데히드는 주어진 표면주의에서 근육 조직으로 약 0.1 cm 침투으로 EM 샘플들의 한 사이즈가 더 두꺼운보다 0.2 cm이다 않도록주의해야한다. EM 직접 수축 평가 장치의 훌륭한 수단으로 또한 일부 연구자들은 전략을 개발 한 근육 전에 고정에 미리 긴장 또는 사전 스트레칭 생리학 관련 긴장으로 수축 요소를 측정 할 수 있도록한다. 이 사전 장력에 대한 표준 프로토콜은 없지만, 두 가지 전략은 간단하게이 프로토콜에 설명되어 있습니다. 그것은 그들이 매우 특정한 방식으로 수행되고, 그것은 비표준 통해 근절 길이 인공적 변경을 방지하기 위해 슬랙 상태에서 근육을 고정하는 것이 바람직 할 수있다 않는 근육은 예측할 수없는 결과를 초래할 수 사전 인장하려고 주목해야한다 사전 장력 절차 8,9. 이러한 특정 측정은 대부분 B를 포함하여 (필요하지 않은되는 근육임상 목적을 위해 수행 iopsies)가 근육을 긴장 미리보기하기위한 노력은 일반적으로 이루어지지되고, 근육 형태에 주요 효과는 근육 sarcomeres의 불균일 한 간격이다.
이 논문은 선천성 근육 질환 필드 테스트의 성능 SOP를 제공하는 시리즈 제를 의미하고, 일상적 셀룰러 분자 기능성 생리 수행 선천성 근육 질환 분야에서 20 전문가의 노력을 나타내고, 병리학 적 연구. 게시 된 SOP의 범위는 다음 해에 사용할 수 있으며 각에 필요한 프로토콜 및 해당 출판물의 형식은이 SOP 노력의 목표는 제공하는 것입니다 워싱턴 DC 2013 년 4 월에 개최되는 선천성 근육 질환 컨소시엄 워크샵에서 논의 된 1) m로 우리의 분야에서 사용되는 방법과 끝점을 표준화하기 위해 선천성 근육 질환 분야에서 필요한 시험 및 검체 분석 용 로드맵가능하고 UCH 2) 우리의 분야에서 새로운 연구에 대한 표준 관행에 명령을 제공합니다. 우리는 이러한 자원은 우리의에서 연구 된 분야에 새로운 수사관의 진입을 용이하게하고, 따라서 수행 할 수있는 연구의 범위를 향상시킬 수 있다고 생각합니다. 또한, 관행의 표준화 연구를 통해 데이터를 비교하고 전임상 및 임상 시험을 계획하고 수행 할 때 엔드 포인트를 식별하는 데 매우 도움이 될 것입니다.
이 문서의 주요 초점은 다양한 연구에 적합한 동결 및 조직의 준비와 관련이 있지만, 우리의 협력 그룹은 또한 근육 표본의 병리학 적 분석을위한 유용한 끝점을 논의했다. 현재,이 병적 인 분석을 수행 할 때 취할 수있는 방법에 대한 공식적인 합의가없고, 다른 연구의 다양한 각각의 질병에 대한 사전 출판물에 새로운 연구 결과를 관련시키는 수행됩니다. 따라서, 우리는 그것이 유용 할 것이라고 생각근육 병리 특성에 병적 인 엔드 포인트의 계획에 대한 몇 가지 일반적인 지침을 제안한다. 이전 연구에서 병리 정량화에 상당한 생각) (1)에 섬유 크기 측정 방법을 넣어되어야 2) 섬유 타입 별 이상 또는 치료 효과의 가능성은, 3)의 이상 또는 효과의 가능성이 제한되는 각각의 근육에, 4) 연구에서 질병에 대한 특징적인 병리 소견을 정량화하기위한 전략. 섬유 크기는 대부분의 연구에 필요한 엔드 포인트이며, 불행히도 정량 방법에있는 광대 한 차이가 있습니다. 많은 연구는 독자적인 이미징 소프트웨어가 제공하는 자동화 된 정량 방법을 사용하여 이러한 결과를보고 있지만, 이러한 프로그램의 대부분은 이러한 자동화 된 측정이 부정확 한 렌더링 할 수 있습니다 (예 : 섬유는 원이나 타원 것을 가정 등) 바로 가기를 취할. 이들 자동화 된 프로그램이 자신의 측정 B를 만드는 방법을 이해하는 것이 필요하다efore 측정에 대한 자신감을 가지고, 우리는 종이 방법에 이러한 내용을 포함하는 조사를 바랍니다. 또한 섬유 크기를 나타내는 데 사용되는 구체적인 측정은 매우 변수이며, 일부 측정은 다른 10,11에 바람직하다. 섬유 크기의 일반적으로 사용되는 측정은 생리 학적 연구를 수행하는 연구자는 자신의 악기를 사용하여 수득 CSA 측정에 그들의 결과를 표준화하기 때문에, 특히, 섬유의 단면적 (CSA)이다. CSA 측정이 정확하게 완벽한 가로 섹션에서 섬유의 크기를 반영 할 수있는 동안 불행하게도, 그들은 (종 방향 또는 경사 단면 섬유는 인위적으로 높은 CSA 측정을 미칠 정도) 섬유 방향에 광범위하게 의존하는 섬유의 크기에 따라서 적합하지 측정을 예로들 수 있습니다. 섬유 단면적에 덜 의존 섬유 크기의 바람직한 측정 번째의 측정이다 최소의 Feret 지름 (MinFeret 직경)이며근육 세포 (12) 전자 곡경. 이 측정은 섬유 방향에 약간 의존 일반적으로 섬유 측정을위한 임상 금 표준이며, 조사는이 기술을 사용하는쪽으로 이동하는 것이 좋습니다. 이러한 측정들은 CSA 측정 (13)을 생성하는 동일한 소프트웨어를 사용하여 만들 수 및 수동으로 측정하는 간단하다 할 수 있습니다. 섬유 유형, 특정 근육과 특정 질환과 관련된 병리 소견의 컨텍스트에 따라 병리학 적 데이터를 평가에 대하여,이 단지 연구 계획 단계에서 고려되어야 덜 논쟁 거리이다. 섬유 유형은 면역 조직 염색 또는 ATP 아제를 사용하여 평가 될 수 있지만, 특정 근육과 동물 종은 이러한 유형의 섬유의 특정 혼합물 (따라서 서로 다른 기대치를 필요로하고 전략 테스트)이 있는지 체크하는 것이 유용하다. 근육 특정 병적 인 참여 또는 치료 효능발생하고, 전체 근육 중량 컨트롤에 비해 병리학 적 평가하는 근육을 결정하기 전에 질병의 불균일의 정도를 식별하는 데 사용될 수있다. 마지막으로, 잘 많은 근육 질환이 (예 : 네 말린 근육 병증의 네 말린 막대와 같은) 특정 병리학 적 이상 (14, 15)과 관련된 것으로 알려져있다, 그래서 이들의 이상이 섬유 형 또는 근육에서 발견되는 여부를 고려하는 것도 유용합니다 특정 분포 16,17 분석을 수행하는 단계를 포함한다. 우리가 근육의 평가를위한 기준의 유연성 세트를 제안하지 않지만 전반적으로, 우리는이 문제가 이전에 어떤 골격 근육 질환의 병리학 적 연구의 성과에 고려되어야한다고 믿는다.
The authors have nothing to disclose.
This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750 and L40 AR057721). We would also like to thank Dr. Julie Tetzlaff for her assistance in revising this manuscript.
For tissue freezing | |||
Liquid nitrogen Dewar with a liquid withdrawal device | Custom Biogenic Systems | Lab-5 Series | Any other liquid nitrogen dewar could substitute. |
Cold-conductive container | Fisher | 02-583A | |
Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen | Nalgene | 4150-2000 | |
Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer | Thomas Scientific | 1228Y01 | Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing. |
For single fiber functional testing | |||
Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
Sylgard coating | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
Dissection stereomicroscope | Harvard Apparatus | 693101 | Any other dissection microscope could substitute. |
For cell culture | |||
Sterile laminar flow hood | Thermo Scientific | 51022485 | Any other cell culture hood could substitute. |
Materials | |||
For tissue freezing | |||
Plastic bags/containers | Nasco | B01009WA | |
Thermal safety gloves | Denville | G4162 | |
Face shield | Fisher Scientific | S47640 | |
Long forceps | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
Marker | Staples | 125328 | |
For cell culture | |||
Sterile 50 mL conical tubes | Denville | C1060-P | |
PES filter unit, 500 mL, 0.22 µm | Denville | F5227 | |
Sterile forceps | Fisher Scientific | 644320 | |
Ice packs | Fisher Scientific | NC9909223 | |
Insulated Styrofoam box | Polar Tech | 207F | |
Packing tape | Staples | 795570 | |
Reagents | |||
Tissue Freezing | |||
Liquid nitrogen | Airgas | NI NF160LT350 | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
Isopentane (2-methylbutane) | Sigma | M32631-4L | Store Isopentane in a flammable materials cabinet. |
EM fixative (choose one) | The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM. | ||
2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 16537-15 | |
Karnovsky's fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer) | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
For functional studies (if desired) | |||
Relaxing solution, containing (in mmol/L) | |||
40 BES | Sigma | B9879 | |
10 EGTA | Sigma | E4378 | |
6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
1.0 DTT | RPI | D11000 | |
46.35 K-propionate | Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
15 creatine phosphate, pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
0.4 leupeptin | Calbiochem | 10895 | |
0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
Skinning solution, containing | |||
Relaxing solution (See Above) | |||
0.5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Indicating silica granules | |||
Flat pieces of cork (1 x 1 inch) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
Glycerol | Sigma | G2025 | |
For cell culture (if desired) | |||
Complete Growth Medium, containing (for 500 mL) | Sterilize by filtering the solution through a 500 mL 0.22 µm PES filter unit. Store at 4°C and use within 1 month. | ||
395 mL of high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
100 mL of fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F6178 | |
5 mL of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) | Sigma | G1146 | |
Storage requriements | |||
See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications |