細胞質DNAセンシング経路の刺激<em>体外</em>と<em>インビボ</em
Summary
プロトコルの目的は、細胞およびインビボで細胞質DNAセンシング経路を刺激するための最適な方法を使用することである。これは、平滑末端ライゲーションの間に長い、二本鎖DNAの生成を改善することによって達成される。細胞またはマウスは、その後、脂質トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトされる。
Abstract
効率的に先天性免疫応答を刺激するために、DNAは、十分な長さと純度でなければならない。私たちは、必要な特性を持つ二本鎖DNA（dsDNAのは）センシング経路が安価かつ容易に生成することができ細胞質DNAを刺激する手法を提案する。 （CpGモチーフを欠く）、短い合成オリゴヌクレオチドのコンカテマー化によって、二本鎖DNAは、細胞質DNAセンシング経路を活性化するのに十分な長さであるように生成することができる。このプロトコルは、効率的なライゲーションが起こるための環境を提供し、ポリエチレングリコール（PEG）の存在下でオリゴヌクレオチドの平滑末端ライゲーションを伴う。二本鎖DNAコンカテマーを、標準的なトランスフェクションプロトコールによるインビトロでの先天性免疫応答をシミュレートするために、フェノール/クロロホルム抽出により精製後、使用することができる。このDNAはまた、例えば、マウスの耳介に皮内注射することによってインビボでの先天性免疫を刺激するために使用することができる。バイコンカテマー化プロセスとその後の刺激プロトコルを標準化する、自然免疫系の信頼性と再現性の活性化は、製造することができる。
Introduction
DNAは、真核生物は、特定の区画に保つ全ての生物や細胞の重要な構成要素である。自然免疫系の1つの機能は、異物が物理的、外部障壁の違反を介して生物に導入されたときそのような区画化が故障したとき、または識別することである。人体では、正しい区画化を逃れることが少量のDNAを分解する手助けするために存在するタンパク質の数があります; DNA分解酵素I、II、およびIIIは、それぞれ、血漿、エンドソーム、および細胞質ゾル中のDNAを分解する。しかし、DNA分解酵素IIを欠くマウスは、自然免疫系は、外核DNAに応答することを示唆しているインターフェロン1の過剰産生に起因する重度の貧血で死ぬことが示されている。この応答はあっても、Toll様受容体シグナル伝達能力の完全に欠損しているマウスでは発生します。多くの研究は現在、インターフェロン遺伝子（STING）2およびTANK結合キナーゼ1（TBの刺激装置を示しているK1）3は、細胞質中のDNAの検出およびこのシグナル伝達経路は、インターフェロン調節因子（IRF）-3 4を活性化することに関与している。サイトカイン、ケモカイン、およびインターフェロン遺伝子のその後のIRF3依存性転写は、病原体や危険関連分子パターン（PAMPまたはDAMP）5のいずれかに先天性免疫応答の特徴である。
細胞内の核酸センシング経路を研究するための欲求が、他の先天性免疫応答を活性化することなく細胞内にDNAまたはRNAを導入することによって細胞を刺激するための堅牢かつ再現性のある方法を開発する必要性につながっている。 STING / TBK1 / IRF3経路を刺激することのできる一つの方法は、そのようなDNA-PK、IFI16、およびCGAS 6-8のようなDNAセンサによってアクセスすることができる細胞質内に核酸を送達するためにカチオン性脂質トランスフェクション試薬を使用することによるものである。
現在effのを可能にするように理解されているDNAの特性他の経路の刺激なしの細胞質先天性免疫応答のicient活性化は、その長さ、質量、純度であり、およびCpGの欠如は4,7,9をモチーフ。合成オリゴヌクレオチドは、それらがDNA配列は、純粋な化学種として最適化して調製することを可能にするように先天性免疫応答を生成するために非常に適している。 45塩基対の免疫刺激DNA（ISD）配列は、この目的に適しは、CpGのないシーケンスであるとステットソンら 4により同定された。この二本鎖DNAシーケンスは、そうでなければランダムであり、CpGモチーフの欠如を超えていない特定の機能を持っていません。私たちは、有意に長いストランドにISDオリゴヌクレオチドをconcatemerizingによる刺激7の大きさを増大させることを見出した。コンカテマーISDの生成は、細胞質先天性免疫応答を刺激するために有用である。ここでは、この試薬 を調製するためのプロトコルを提示し、それがDNA にセンシング経路を活性化する方法を試験管内だけでなく、in vivoで 。
注：すべての動物実験が承認制度プロトコルや動物のケアのガイドラインの下で行われている。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するプロトコルは、広範囲の細胞型およびin vivoで再現性のある結果を持つ細胞質ゾル先天性免疫応答を刺激する二本鎖DNAを生成するために使用される。使用される主な基質試薬は合成オリゴヌクレオチドであるので、代わりのDNA配列または化学修飾を使用するためのこのシステムの柔軟性がある。それは、例えば、蛍光標識または局在化を追跡したり、他の生体分子との相…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、確認応答がありません。
Materials
| Forward Primer | Integrated DNA technologies | n/a | TACAGATCTACTAGTGATCTATGACTGATCTGTACATGATCTACA |
| Reverse Primer | Integrated DNA technologies | n/a | TGTAGATCATGTACAGATCAGTCATAGATCACTAGTAGATCTGTA |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | P-4463 | |
| Molecular biology grade water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| T4 Polynucleotide Kinase | Promega | M4101 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | |
| Phenol:Chloroform | Fisher Chemical | BPE1752p-400 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | C/4960/PB08 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| DNA gel loading buffer | New England biolabs | B7021S | |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Optimem | Life Technologies | 11058021 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bioscience | MIR 2300 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 80901 Model 1705 | |
| 30G needles | BD bioscience | 304000 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | |
| Rneasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Oligo(dT) primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | |
| Super Script III reverse transcriptase | Life Technologies | 56575 | |
| First strand cDNA synthesis buffer | Life Technologies | y02321 | |
| SybrGreen qPCR Fast master mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| cxcl10 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | ACTGCATCCATATCGATGAC |
| cxcl10 murine reverse primer | Integrated DNA technologies | n/a | TTCATCGTGGCAATGATCTC |
| il6 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
| il6 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
Referencias
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