Die Verwendung von fluoreszierenden Ziel Arrays zur Beurteilung der T-Zell-Antworten<em> In-vivo-</em
Summary
Die Fähigkeit, T-Zell-Antworten im Detail in vivo Überwachung ist wichtig für die Entwicklung des Verständnisses der Immunantwort. Hier beschreiben wir die Verwendung von fluoreszierenden Zielarrays (FHA) de einem in vivo-T-Zell-Assay,> 250 Parameter beurteilt gleichzeitig mittels Durchflusszytometrie.
Abstract
Die Fähigkeit, T-Zell-Antworten in vivo zu überwachen, ist wichtig für die Entwicklung des Verständnisses der Immunantwort und die Gestaltung der Immuntherapie. Hier beschreiben wir die Verwendung von fluoreszierenden Zielarrays (FTA)-Technologie, die Vitalfarbstoffe wie Carboxyfluoreszein Succinimidylester (CFSE), violetten Laser erregbar Farbstoffe (CellTrace Violett: CTV) nutzt und rote Laser erregbar Farbstoffe (Dye Cell Proliferation eFluor 670: CPD ) Etiketten Maus Lymphozyten in> 250 erkennbar fluoreszierenden Zellhaufen kombinato. Zellhaufen innerhalb dieser Freihandelsabkommen mit Haupthistokompatibilitäts (MHC)-Klasse-I und MHC-Klasse-II-bindenden Peptiden gepulst werden und dienen als Zielzellen für CD8 + und CD4 + T-Zellen, die jeweils damit. Diese FTA Zellen lebensfähig bleiben und voll funktionsfähig und kann daher in Mäuse verabreicht werden, um Beurteilung der CD8 + T-Zell-vermittelte Abtötung von Zielzellen und FTA CD4 + T-Zell-meditierten hel ermöglichenp von freien Zielzellen B-Zellen in Echtzeit in vivo durch Durchflusszytometrie. Da> 250 Zielzellen auf einmal geprüft werden, ermöglicht die Technik der Überwachung der T-Zell-Antworten gegen verschiedene Antigen-Epitope in verschiedenen Konzentrationen und in mehreren Wiederholungen. Als solche kann die Technik T-Zell-Antworten sowohl auf quantitative (zB der kumulativen Größe der Antwort) und eine qualitative (z. B.. Funktionelle Avidität und Epitop-Kreuzreaktivität der Antwort-) Pegel zu messen. Hier beschreiben wir, wie diese Freihandelsabkommen sind konstruiert und geben ein Beispiel, wie sie angewendet werden, um T-Zell-Antworten durch einen rekombinanten Pockenvirus-Impfstoff induziert beurteilen.
Introduction
T-Zellen spielen eine zentrale Rolle in der adaptiven Immunantwort und werden oft für die Manipulation in der Immuntherapie richtet. CD4 + Effektor-T-Zellen reagieren auf fremde Antigen durch Sekretion von Zytokinen, die viele Aspekte der Immunität regulieren und kann auch direkt helfen, B-Zellen, Antikörper zu produzieren. CD8 + zytotoxischer T-Zellen (CTLs) können auch Fremdantigen reagieren durch Sekretion von Zytokinen und spielt eine zentrale Rolle bei der Abtötung von Zellen direkt ein fremdes Antigen exprimiert. Die grundlegende Interaktion, die diese T-Zell-Effektorfunktionen initiiert beinhaltet die Interaktion des T-Zell-Rezeptor (TCR) mit fremden Peptiden auf MHC-Molekülen auf der Oberfläche von Zellen angezeigt. CD4 + T-Zellen erkennen Peptide an MHC-Klasse-II-Molekülen auf Antigen-präsentierenden Zellen und CD8 + T-Zellen erkennen das Peptiden auf MHC-Klasse-I-Moleküle, die typischerweise auf Mikrobe infizierten Zellen angezeigt werden, angezeigt.
Umdie Rolle T-Zellen in einer Immunantwort spielen zu beurteilen, ist es wichtig, dass ihre Effektor-Funktionen werden durch zuverlässige und empfindliche Methoden gemessen. Gemeinsame Methoden für die T-Zellantwort Bewertung einzubeziehen; MHC-Tetramer class-I/II/peptide Reaktivität; Zytokin-Produktion durch ELISPOT und intrazellulären Zytokin-Färbung; und Tötungskapazität von 51 Cr-Release-Assays. Diese Tests sind jedoch in der Regel ex vivo durchgeführt in vitro Stimulation oder einen begrenzten Einblick in die T-Zellfunktion. Idealerweise bei der Messung von T-Zellantworten wäre es vorteilhaft, diese in situ zu beurteilen, in vivo, wie sie auftreten, ohne Manipulation von T-Zellen, so dass Änderungen der funktionellen Parameter, die durch in vitro-Stimulation auftreten können, zu vermeiden. Einige der am häufigsten in vivo T-Zell-Funktionsassays verwendet werden zur Messung CTL-vermittelte Abtötung von Zielzellen, die mit MHC-Klasse I-bindenden Peptiden gepulst, die in vivo aufgezählt werden basierendüber deren Nachweis durch Fluoreszenzmarkierung mit Vitalfarbstoffe wie CFSE. Während diese Arten von Tests können CTL-vermittelte Abtötung von Zielen zu überwachen, wenn sie in vivo vorkommen, sie vorher eine relativ begrenzte Kapazität zur Tötung von mehreren Zielen präsentiert verschiedenen Konzentrationen und verschiedenen Typen von Peptid-Epitopen, die erforderlich ist, qualitative Parameter, damit beurteilt hatten als funktionelle Avidität und Epitop Variante Kreuzreaktivität bewertet werden. Diese Tests auch nicht bieten keine Informationen über CD4 + T-Zell-vermittelte Reaktionen.
Zu überwinden viele der Beschränkungen verwendet werden, um T-Zellreaktionen zu bewerten gegenwärtigen Verfahren, haben wir vor kurzem ein Multiplex-Assay auf Basis von fluoreszierenden Zielarrays (FHA), die die Kontrolle der T-Zell-Antworten gegen> 250 Zielzellen gleichzeitig in einem tierischen ermöglicht entwickelten Durchflusszytometrie 1, 2. Freihandelsabkommen sind von Lymphozyten mit meh beschriftet umfasstBundes Konzentrationen und Kombinationen von Vitalfarbstoffe wie CFSE, CTV und CPD erlaubt> 250 Zellhaufen von einzigartigen Fluoreszenz erzeugt werden. Da diese Zellen lebensfähig und funktionsfähig bleiben, können sie in Tiere injiziert werden, um die Überwachung ihrer Wechselwirkung mit Effektor-T-Zellen in vivo 3 zu ermöglichen. Zum Beispiel kann die FTA Zellcluster mit MHC-Klasse-I-bindende Peptide gepulst werden, um Beurteilung der Antigen-spezifischen CTL-vermittelte Abtötung von Zielzellen 1 zu ermöglichen. Darüber hinaus können die FTA Zellcluster auch mit MHC-Klasse-II-bindenden Peptiden gepulst werden, das eine Bewertung von Antigen-spezifischen T-Helferzellen (T H)-Aktivität durch Bestimmung der Aktivierung (durch Bewertung des Aktivierungsmarker, wie CD69, CD44 und / oder CD62L) von B-Zellen in der FTA Lager verwandten Peptid 2. Seit mehr als 250 Ziele können gleichzeitig erfasst werden, ist es möglich, CTL und T H-Antworten gegen viele Zielzellcluster mit n gepulst messenahlreiche Peptide bei verschiedenen Konzentrationen und die Aufnahme der vielen Wiederholungen. Die FTA-Test ist daher ein beispielloses Niveau von T-Zell-Antwort-Effektor Beurteilung in vivo.
Hier beschreiben wir im Detail die Konstruktion einer FTA und zeigen, wie sie zur Bestimmung der T-Zellantworten in vivo angewendet werden. Das Verfahren beschreibt die Konstruktion eines FTA 252 erkennbaren Zellcluster durch die Verwendung von drei Vitalfarbstoffen, 6 Wiederholungen der 42 Zellcluster mit MHC-Klasse-I und-II-bindenden Peptiden gepulst aufweist, aufweisend. Die Markierung von Zellclustern 42 erfolgt in 10 ml-Röhrchen mit konischem Boden und es ist hilfreich, um diese in einem Reagenzglasgestell lag wie in Tabelle 1 dargestellt. Dieses Verfahren kann für eine kleinere Anzahl von erkennbaren Cluster eingestellt, wie durch die Verringerung der Menge der Markierung erforderlich jeder Farbstoff 1 durchgeführt.
Wir zeigen den Nutzen des Tests zeigen, wie es Respons messenes durch rekombinante Pocken-Virus-Impfung gegen mehrere Epitope in einer kleinen Kohorte von Mäusen erzeugt. Dies zeigt, wie das Freihandelsabkommen Test kann verwendet werden, um kumulative Antworten und funktionelle Avidität durch zu messen, bzw. die Verwendung von Fläche unter der Kurve (AUC) Untersuchungen bzw. die Messung der effektiven erforderlich, um die Hälfte der maximalen Antworten (EG 50) erzeugen Peptidkonzentration werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Vorteil der FTA-basierten Assays ist, dass sie die Unterscheidung von> 250 lebensfähigen und funktionsZielZellPopulationen aus einer Wirtstier durch Durchflusszytometrie zu ermöglichen. Dies bietet ein Maß an Komplexität in vivo Durchflusszytometrie basierenden Assays, die bisher nicht möglich war vor. Dies wird in den 2 oben gezeigt Tierversuchen, in Reaktion auf 7 verschiedene virale Epitope bei 6 Konzentrationen könnten in Replikaten von 6 gleichzeitig in einem einzigen Tier erlaubt Parameter wi…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Project Grants # 1010395 (BQ und CP) und # 525431 (CR), und einem Programm Zuschuss # 455395 (CP) aus dem National Health and Medical Research Council of Australia, einem australischen Zentrum für Hepatitis-und HIV-Virologie EOI unterstützt 2012 Stipendium (CR und RJJ) und einem Zuschuss von der Gordon und Gretel Bootes Foundation (BQ und CR). Wir möchten Harpreet Vohra und Michael Devoy für ihre hervorragende Pflege des JCSMR FACS Labor danken, die australische Cancer Research Foundation Biomolekulare Ressourcenfazilität, JCSMR, ANU, für die Peptidsynthese, und Dr. David Boyle, CSIRO Animal Health Laboratories, Geelong, Australien für die Bereitstellung der Mutter HIV-Impfstoff-Aktien.
Materials
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Fetal calf serum | Serana | FCS-500 | |
| CTV | Invitrogen | C34557 | |
| CFDA, SE | Invitrogen | C1157 | |
| CPD | eBioscience | 65-0840-90 | |
| anti-B220 PerCp-Cy5.5 | eBioscience | 110730 | |
| anti-CD69 brilliant violet 605 | Biolegend | 104529 | |
| PKH-26 | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Vortex | Scientific Industries Inc | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) | BD Bioscience |
Referencias
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