Floresan Proteinleri kullanarak Afrika tripanosom içinde Glycosome Dynamics Monitör

Summary

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Abstract

Trypanosoma brucei sığır ^1, insan Afrika trypanosomiasis (HAT), ya da uyku hastalığı ve israf hastalığı, nagana neden olan bir kinetoplastida parazittir. Memeli konakçının kan ve çeçe sineği vektörü arasındaki parazit seçim yapar. Pek çok hücresel organellerin bileşimi bu farklı hücre dışı koşullara ^2-5 cevaben değişir.

Glycosomes glikoliz katılan enzimlerin çoğu bölmeli olan yüksek seviyede uzmanlaşmış peroksizomlar bulunmaktadır. Gelişimsel ve çevresel düzenlenmiş şekilde ^4-11 Glycosome kompozisyon değişir. Şu anda, glycosome dinamiklerini incelemek için kullanılan en yaygın teknikler elektron ve floresan mikroskopisi; pahalı, zaman ve emek yoğun ve yüksek verimlilik analizleri kolayca adapte değildir teknikleri.

Bu sınırlamaları, bir flüoresan raportör sistemi-glycosome üstesinden gelebilmek için,¹² glycosomes için, füzyon proteini yönlendiren peroksizom hedefleme dizisi (PTS2) kaynaşır sarı floresan protein (EYFP) geliştirilmiş olan kurulmuştur. PTS2eYFP füzyon proteininin ithalinde, glycosomes floresan olur. Organel bozulması ve akış sitometrisi ile ölçülebilir floresans kaybı geri dönüşüm ile sonuçlanır. Hücrelerin büyük sayılar (5,000 hücre / sn) gibi tespit ve montaj gibi geniş numune hazırlama olmadan gerçek zamanlı olarak analiz edilebilir. Bu yöntem, çevre koşulları dalgalı yanıt olarak bir organel kompozisyonunda değişikliklere tespit hızlı bir yol sunar.

Introduction

Trypanosoma brucei sığır Afrika insanlarda uyku hastalığından ve israf hastalığı, nagana neden olur. Bu hastalıkların tedavisinde kullanılan ilaçlar, aşılar mevcut değildir, eskimiş ve son derece zehirlidir ve ilaç direnci gelişimi için potansiyel yeni ilaç hedefleri ¹ için arama gerektirir.

Ömrünün, T. sırasında brucei, bir böcek vektör ve memeli ev sahibi arasında dönüşümlü; parazit hayatta gerekir hangi çok farklı ortamlarda sergileyen iki ana. Parazit farklı çevre koşullarına maruz gibi metabolik ve morfolojik değişikliklerin bir dizi ortaya çıkar. En dramatik değişikliklerden bazıları tek-zar-sınırlı parazit özgü Mikrocisimler gözlenir, glycosomes ¹³ adlandırılır.

Glukoz seviyeleri nispeten yüksek (~ 5 mM) kan ve kan parazitler (BSF) glikolisis wh ile sadece ATP üretmekIle mitokondriyal metabolizma ¹⁴ bastırılır. Ökaryotlarda farklı olarak, glikoliz, sitoplazma, T. oluşur brucei glycosomes ^14,15 glikolitik enzimlerin çoğu compartmentalizes. Parazitler, bir bloodmeal sırasında çeçe sineği tarafından alınır ve sinek tarafından sindirildikten 15 dakika içinde tespit edilemez seviyelere düşer glikozunda bir düşmenin, yaşarlar. Böcek metabolizması, procyclic formu (PCF), parazit daha esnek ve glukoz gibi, prolin gibi amino asitler, ^{ATP, 16-18} sentezinde kullanılabilir olduğunu. Karşılaştırmalı proteomik çalışmalar yaşam döngüsü glycosomal bağımlı değişiklikler ve kan parazitlerin artan glikolitik proteinler ile mitokondriyal proteinler ve TCA döngüsü ve solunum zincirinde ^13,19 katılan mitokondriyal proteinleri ortaya. Birçok çalışma BSF ve PCF glycosomes arasındaki farklar odaklanmış olsa da, küçük env tepki olarak ortaya PCF glycosomes değişiklikler hakkında bilinmektedirironmental değişir.

Sineğin hindgut, glukoz düzeyleri bir beslenme ²⁰ sırasında geçici artışlar ile düşüktür. In vitro çalışmalar çoğunda, PCF parazitler glikoz içeren ortamda yetiştirilmektedir. Ancak son çalışmalar önemli ölçüde yanıt PCF metabolizma değişiklikleri durumunu ¹⁷ glikoza olduğunu göstermiştir. Glukoz, prolin alım ve prolin dehidrojenaz aktivitesi artışı ¹⁸ yokluğunda. Mitokondrial metabolizmanın bu değişiklik muhtemelen glycosome kompozisyon ve morfolojisinde bir değişime de eşlik eder, bununla birlikte, bu direkt olarak değerlendirilmemiştir.

Elektron ve floresan mikroskobu yaygın teknikler T. glycosome dinamiklerini incelemek için kullanılır brucei ^2,21-24. Bu protokoller, zaman ve yoğun, pahalı ve gerçek zamanlı çalışma ve yüksek verimli protokollere adapte zor doğum. Bir floresan-organel muhabiri sistemi u bu sınırlamayı aşmak içinmemeli hücreleri ve maya sistemlerinin organellere çalışma sed T. kullanılmak üzere modifiye edilmiştir brucei ^12.

Floresan-organel haberci sistemleri yaygın gibi maya, bitki ve memeli hücreleri de ^25-27 gibi daha yüksek ökaryotlardaki kullanılmıştır. Bu gibi sistemlerde, bir flüoresan proteini spesifik organellere proteini hedefler bir amino asit sekansına kaynaştırılır. Hedef proteinlerin bozulması veya sentez floresan ölçülmektedir ve organel bileşim değişiklikler hücre flüoresanlıktaki değişikliklerle yansıtılmaktadır.

Geliştirilmiş sarı floresan proteini (EYFP) 'nin açık okuma çerçevesi, bir tip II peroksisomal hedefleme sekansı (PTS2) ve ¹² bağlı olduğunda, olgun bir protein PTS2eYFP, ithal yetkin glycosomes ve floresan içine alınır, akış sitometrisi vasıtasıyla izlenebilir. Glycosome bileşim içinde varyasyonlar hücresel flüoresanlıktaki değişikliklerle yansıtılmaktadır. Bu sistem, resol yardımcı olabilirglycosome bileşim içinde çevreden kaynaklanan değişiklikler belirleyen mekanizmaları VING.

Bu yazıda canlı parazitlere gerçek zamanlı glycosome dinamiklerini izlemek için akış sitometrisi ile bağlantılı PCF parazitler bir glycosome raportör sistemin üretimini tarif ve farklı ortamlarda yanıt olarak glycosome bileşim değişimlerin izlenmesi için kullanılmıştır bir örnek sağlamaktadır. Taze ortam glycosome kompozisyonunda değişikliklere tetikler içine Özet olarak, bileşim, glycosome hücre dışı glükoz konsantrasyonu ve log-faz geçişi kültürlerin etkilenir. Bu sistem tripanozomlarına ve diğer parazitlerin diğer organellerin dinamik davranışlarını incelemek için modifiye edilebilir.

Protocol

1. Genel Trypanosome Yetiştiriciliği SDM79 ortamlarının hazırlanması (Tablo 1), katı madde tartılır. 4 50 ml konik ° C veya bir plastik torba saklayınız. NOT: Reaktifler, en az 6 ay stabildir. Çözülme fetal inek, bir 37 ° C su banyosunda serumu (FBS) ve tersine periyodik olarak karıştırın. NOT: FBS steril bir çözelti olarak tedarikçiden alınır. FBS sterilize parazit büyümeyi desteklemek kabiliyetini azaltır. Tüm şişe çözülmüş s…

Representative Results

Bu sistemde, glycosome bileşim içinde bir glukoza bağımlı bir değişiklik gözlenmemiştir. Hücreleri glikoz içeren ortamda yetiştirildiği zaman, iki nüfus gözlenir; Bir parlak ve bir loş (Şekil 2A). Dim hücreler parlak hücreler olgun ve olgunlaşmamış glycosomes 12 bir karışımını barındıran süre PTS2eYFP ithal değil olgunlaşmamış glycosomes, liman. Glikoz ortamı içinde mevcut olduğunda, protein glycosome mislocalization 15,28 öldürücü ve glycos…

Discussion

Glycosomes temel, dinamik, parazit özgü organellerdir. Bu organellerin biyogenezi, bakım, çoğalması ve biçimlenme düzenleyen süreçler olası terapötik amaçlar için istismar edilebilir ilaç hedefleri arasındadır. Bu tür ilaç hedefleri potansiyel olarak yüksek bolluğuna rağmen, daha glycosome biyogenez alan baskın nedeniyle, hızlı ve dinamik organel karşılıklarının izlenmesi için olan bir izlenebilir, yüksek hacimli sistem eksikliği, bir başka organizmalarda benzer süreçlerle ilgili çal…

Materials

Adenosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A10781	SDM79 Ingredient
L-Alanine	Avocado Research Chemicals Ltd	A15804	SDM79 Ingredient
L-arginine	CalBiochem	1820	SDM79 Ingredient
p-aminobenzoic acid	ICN Biomedicals	102569	SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100X)	Sigma	B6891	SDM79 Ingredient
Biotin	Fisher	BP232-1	SDM79 Ingredient
Calcium Chloride	VWR	BDH0224	Cytomix
EDTA	Fisher	S311-100	Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit	Omega Biotek	D2500-01	DNA purifiation
Research grade Serum	Fisher	03-600-511	SDM79 Ingredient
Folic acid	ICN Biomedicals	101725	SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl	ICN Biomedicals	194671	SDM79 Ingredient
Glucose	GIBCO	15023-021	SDM79 Ingredient
L-glutamine	CalBiochem	3520	SDM79 Ingredient
Glycerol	Acros Organics	Ac15892-0010	Freezing media
Graces insect cell media powder	GIBCO	11300-043	SDM79 Ingredient
Hemin	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Guanosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A11328	SDM79 Ingredient
HEPES	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Magnesium Chloride	Fisher	BP214-500	Cytomix ingredient
L-methionine	Fisher	BP388-100	SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50X)	Cellgro	25-030-CI	SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100X)	Lonza	13-114E	SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1X) with L-glutamine	Cellgro	10-010-CM	SDM79 Ingredient
MOPS	Fisher	BP308-500	SDM79 Ingredient
Sodium Biocarbonate	Fisher	S233-500	SDM79 Ingredient
Penicillin-Streptomycin Solution	Cellgro	30-002-CI	SDM79 Ingredient
L-phenylalanine	ICN Biomedicals	102623	SDM79 Ingredient
Potassium Chloride	Fisher	P217-500	Cytomix ingredient
Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisheer	P290-212	Cytomix ingredient
L-proline	Fisher	BP392-100	SDM79 Ingredient
L-serine	Acros Organics	56-45-1	SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt	Acros Organics	113-24-6	SDM79 Ingredient
L-taurine	TCI America	A0295	SDM79 Ingredient
L-threonine	Acros Organics	72-19-5	SDM79 Ingredient
L-tyrosine	ICN Biomedicals	103183	SDM79 Ingredient
E.Z.N.A.Cycle Pure kit	Omega Biotek	D6492-02	DNA purification
Binding buffer	Omega Biotek	PDR041	DNA purification
SPW wash buffer	Omega Biotek	PDR045	DNA purification
Gene Pulser Xcell	Biorad	165-2660	Trypanosome transformation
4 mm electroporation cuvettes	VWR		Trypanosome transformation