Режиссер дофаминергических Neuron Дифференциация от человека плюрипотентных стволовых клеток
Summary
We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson’s disease.
Abstract
Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson’s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.
Introduction
Дофаминергический (DA) нейроны можно найти в нескольких областях мозга, в том числе среднего мозга, гипоталамуса, сетчатке и обонятельных луковиц. Нейроны A9 DA в черной субстанции Парс компактов (SNPC) поведения управления и движения, проецируя на полосатом теле в переднем мозге и формирования экстрапирамидной системы двигателя. Вырождение A9 DA нейронов приводит к болезни Паркинсона (БП), который является вторым наиболее распространенным человек нейродегенеративные расстройства и в настоящее время неизлечимыми. Замена Клеточная терапия является одним из наиболее перспективных стратегий для лечения PD 1, поэтому, там был большой интерес при выводе A9 DA нейроны от человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs), в том числе и человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и Недавнее человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs).
Много исследований попытались вывести A9 DA нейроны от hPSCs с использованием различных методов. Самые ранние отчеты все генерируемые DA нейроны через нейроннуюрозетка этап предшественников. По совместном культивировании с MS5 2 или ПА6 3-5 стромальных клеток с или без внешних факторов роста в течение 2-4 недель, L. Studer и коллегами и трех других групп успешно индуцированных ЭСК, чтобы произвести нейронных розетки. Затем они обогатили эти розетки от механического вскрытия или ферментативного расщепления для дальнейшей дифференциации. В других докладах, исследователи генерируется нейронных розетки через эмбриоидов тела (EB) плавающие культуры дифференциацию 6-9. Позже исследователи установили монослоя на основе метода дифференциации 10,11, где они покрытием ЭСК и hiPSCs на внеклеточного матрикса, добавили различные факторы роста в культуре, чтобы вызвать дифференциацию hPSCs к DA нейронов, которая имитирует в естественных условиях развития эмбриональных DA нейронов . Хотя все эти исследования получены тирозингидроксилазу (TH) экспрессирующие клетки с некоторыми характеристиками DA нейронов, весь процесс дифференциации время и трудоемким,как правило, неэффективно, и что более важно, A9 идентичность этих нейронов не были продемонстрированы в большинстве исследований, кроме одного с LMX1a эктопической экспрессии 12. В последнее время новый плиты перекрытия (FP) основанное был разработан протокол 13-16, в котором предшественники FP с DA нейронов потенциала были впервые подготовлена путем активации звуковой ежа и канонических Wnt сигнальных путей на ранней стадии дифференцировки, а затем эти клетки FP были дополнительно указываться в DA нейронов. Хотя этот протокол является более эффективным, все еще существуют некоторые проблемы; Например, весь процесс дифференциации занимает много времени (по крайней мере, 35 дней), и это зависит от клеток-фидеров 15, или EB зависит 16 или личность A9 не была продемонстрирована 14.
Здесь, на основе знаний из в естественных условиях эмбрионального развития DA нейронов и опубликованных результатов других исследователей, мы оптимизировали условий культивирования для эфпоколение циент из DA нейронов обеих ЭСК и hiPSCs. Мы сначала формируют клетки FP-предшественников путем активации канонической передачи сигналов Wnt с небольшой молекулы CHIR99021 и звуковой еж сигнализации с малых молекул SAG и purmorphamine. Эти FP клетки выразить Foxa2, LMX1a, Корин, Otx2 и нестин. Мы тогда определенном эти FP клетки к DA нейронов с факторами роста, включая BDNF, GDNF, и т.д.. Сформированные DA нейроны имеют A9 типа клеток, поскольку они являются позитивными для GIRK2 а отрицательный для кальбиндин 17. Этот протокол подачи клетка или EB независимо, высокой эффективностью и воспроизводимостью. Используя этот протокол, можно получить DA нейроны менее чем за 4 недели от ЭСК или hiPSCs нормальных людей для клеточной трансплантационной исследования, или от hiPSCs пациентов с БП для моделирования в пробирке PD или тестирования потенциальных терапевтических агентов для PD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Стволовые плюрипотентные клетки человека (в том числе обоих ЭСК и hiPSCs) могут быть дифференцированы в пробирке для создания большинства, если не всех, типы клеток нашего тела, включая DA нейронов, которая была продемонстрирована в предыдущих исследованиях 19. Здесь, на основе зн…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank members of the Renee Reijo Pera laboratory for help during development of this protocol and during preparation of this manuscript. This work is supported by California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) shared laboratory (CL-00518).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
Referencias
- Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
- Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
- Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, 669-674 (2004).
- Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, 925-940 (2004).
- Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
- Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
- Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
- Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson’s disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
- Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
- Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson’s disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson’s disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
- Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).
