Isolement, identification et la purification de cellules murines thymique épithéliales
Summary
Nous décrivons ici un procédé efficace pour l'isolement, l'identification et la purification des cellules épithéliales du thymus de souris (CET). Le protocole peut être utilisé pour l'étude de la fonction du thymus d'un développement normal des lymphocytes T, un dysfonctionnement du thymus et de reconstitution de la cellule T.
Abstract
Le thymus est un organe vital pour le développement des lymphocytes T. Des cellules stromales thymiques, les cellules épithéliales thymiques (CET) sont particulièrement cruciales à plusieurs étapes du développement des cellules T: l'engagement des cellules T, de sélection positive et négative sélection. Toutefois, la fonction de refroidissement thermoélectriques dans le thymus reste incomplètement comprise. Dans cet article, nous proposons une méthode pour isoler des sous-ensembles TEC de thymus de souris frais en utilisant une combinaison de rupture mécanique et la digestion enzymatique. Le procédé permet aux cellules thymocytes et stromales thymiques être efficacement libérés à partir de la cellule-cellule et des connexions de la matrice extracellulaire et de cellules pour former une suspension de cellules isolées. Utilisation de cellules isolées, de cytométrie de flux à paramètres multiples peut être appliqué à l'identification et la caractérisation des TEC et des cellules dendritiques. Parce que les TEC sont une population de cellules rares dans le thymus, nous décrivons également un moyen efficace d'enrichir et de purifier les TEC en appauvrissant thymocytes, type cellulaire le plus abondant dans le thymus. Follol'aile enrichissement, le temps de tri de cellule peut être réduite de sorte que la perte de la viabilité des cellules peut être réduite au minimum au cours de la purification de TEC. Cellules purifiées sont adaptés à diverses analyses en aval comme PCR en temps réel, Western blot et profil d'expression génique. Le protocole de promouvoir la recherche de la fonction TEC et ainsi que le développement de la reconstitution in vitro des lymphocytes T.
Introduction
Au début du développement de cellules T, de la moelle osseuse souches hématopoïétiques progénitrices multipotentes dérivées de cellules sont recrutés dans le cortex du thymus, subir engagement à T lignée et de devenir des précurseurs de cellules T 1. Dans le cortex, précurseurs des lymphocytes T CD4 et CD8 à double négatifs (DN) thymocytes se dilatent et se différencient en immatures CD4 et CD8 positif double (DP) thymocytes, la formation d'une grande piscine avec des progéniteurs très variable T récepteurs cellulaires 1. Seul un sous-ensemble de sélection restreinte au CMH de cellules DP deviendra unique positifs (SP) thymocytes CD4 ou CD8, migrer vers la moelle du thymus, et se différencier en cellules T matures fonctionnellement compétentes, un événement qui est visé à la sélection positive 2 6. En revanche, les clones de thymocytes auto-réactifs sont soumis à une sélection négative et sont évacués par l'apoptose, convertis en cellules T régulatrices pour l'auto-tolérance, ou dérivé de lymphocytes intra-épithéliaux à des fins qui ne sont pas encore clairement 3,7-10.
Dans le thymus, les cellules stromales thymiques forment un microenvironnement unique, pour fournir des signaux destin 5,11,12 ces différents de développement des cellules T. Les cellules stromales thymiques sont composés de cellules épithéliales thymiques (CET) – y compris TEC corticales (CTEC) et TEC médullaires (mTECs), les cellules dendritiques, les macrophages, les fibroblastes, les cellules endothéliales, les péricytes de la crête neurale et d'autres cellules mésenchymateuses 13-15. Parmi ceux-ci, les TEC sont essentiels aux différents stades de développement des cellules T 1,2,16,17. Cependant, l'absence d'un moyen efficace d'isoler TEC a entravé une compréhension globale de leurs fonctions 16. En particulier, CTEC, qui forment un réseau tridimensionnel progéniteurs dans le cortex environnant, sont essentiels pour la sélection positive 13,18,19 pour des raisons qui ne sont pas encore claires. Des études antérieures fournies indices quant à l'hétérogénéité et le rôle des TEC, la plupart s'appuyant sur des outils morphologiques et histologiques 13 </sup>. Récemment, les rôles uniques de sous-ensembles TEC ont été abordés par des approches génétiques dans des modèles murins 12,20. Une façon robuste et reproductible pour isoler TEC est fondamentale pour atteindre la caractérisation objective de sous-ensembles de TEC, une évaluation quantitative et qualitative des fonctions de TEC, et la clarification des mécanismes comment CTEC soutenir la sélection positive.
En raison de la rareté des TEC dans le thymus et les interactions serrés qu'ils forment dans l'organe intact, l'isolement des TEC a été difficile. Le protocole décrit ici est basé sur les découvertes précédentes, actuellement réactifs disponibles, les techniques et les connaissances de la structure du thymus et de la composition du stroma. Il ya près de deux décennies, plusieurs procédures ont été signalés à désagréger les tissus du thymus 21-27, dans lequel les différentes enzymes ont été utilisés lors de la digestion, y compris la trypsine, la collagénase et Dispase. Gray et al. rapport ces enzymes dans leur precedure 28, et fait état d'une amélioration de la méthamphétamineod, avec une digestion multi-étape de cocktails d'enzymes 29 qui sont devenus largement utilisé 20,30. Cependant, cette méthode implique un temps de préparation longs et complexes étapes de digestion et entraîne dernière variable du nombre de cellules et les proportions des TEC, même dans la même cohorte de souris 29,30. Il ya plusieurs années, Libérase enzyme de qualité de la recherche, hautement purifié contenant la collagénase et la protéase neutre commencé à être utilisé dans le tissu du thymus dissociation 30. Ici, nous décrivons un protocole à base de Libérase digestion, avec des procédés de séparation mécanique optimisés, qui donne un grand nombre de dispositifs de refroidissement thermoélectriques viables à partir de tissus de thymus de souris. .
Pour enrichir les cellules stromales dissociés, des études antérieures ont utilisé soit des gradients de densité ou séparation magnétique de perles 21,29. Cependant, les deux méthodes provoquent de graves perdu de certaines populations de cellules stromales thymiques, en particulier la population de CTEC 29. Élimination cytotoxique et techniques panoramique <sjusqu'à> 31,32 ont largement été utilisés pour l'épuisement ou la séparation des lymphocytes dans le domaine immunologique 12,31. Après comparaison de ces techniques, nous avons établi le protocole de panoramique actuel pour l'enrichissement des TEC. La condition douce au cours de la procédure d'enrichissement conduit à moins de la mort cellulaire et impartiale et une récupération accrue de TEC.
La suspension de cellules de thymus isolé décrit dans la section 3 peut être directement appliquée à l'analyse par cytométrie de débit pour l'identification et la caractérisation des sous-populations de cellules dendritiques et TEC. La section 4 décrit une méthode simple et utile pour identifier des sous-TEC à l'aide de flux multiparamétrique cytomètre. Pour les expériences qui cherchent à obtenir CTEC purifiés ou mTECs, l'enrichissement de TEC et procédures de tri cellulaire peut être trouvé dans la section 5 et 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans le protocole, les étapes critiques sont la préparation de cellules stromales thymiques (section 3) et l'enrichissement des TEC (section 4). Il est fortement recommandé que la solution de l'enzyme fraîche est préparée à chaque fois et le tissu est traité dès que possible. Pour thymus commun, l'optimisation du volume de solution d'enzyme est nécessaire, selon le nombre de thymus. Si un résidu de tissu est laissé après le traitement, en ajoutant davantage de solution d'enzyme et l'…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par les Instituts nationaux de la santé Grant R01 AI088209 (à KAH). Nous remercions également l'Université du Minnesota cytométrie en flux de ressources.
Materials
| Anti-mouse EpCAM | eBioscience | XX-5791-YY* | Clone G8.8 |
| Anti-mouse MHC II | eBioscience | XX-5321-YY* | Clone M5/114.15.2 |
| Anti-mouse Ly51 | eBioscience | XX-5891-YY* | Clone 6C3 |
| UEA-1 | Vector Laboratory | FL-1061 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | |
| Flow cell sorter | BD Biosciences | FACSAria | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
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