In vivo beeldvorming van Dauer-specifieke neuronale Verbouwing in C. elegans

Summary

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant ‘dauer’ juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

Abstract

De mechanismen die stress geïnduceerde fenotypische plasticiteit bij dieren vaak complex en moeilijk te bestuderen in vivo. Een klassiek voorbeeld van stress geïnduceerde plasticiteit is het dauer stadium van C. elegans. Dauers een alternatief ontwikkelings larvale stadium gevormd onder omstandigheden van lage concentraties van bacteriële voedsel en hoge concentraties van een dauer feromoon. Dauers geven uitgebreide ontwikkelings-en gedragsproblemen plasticiteit. Bijvoorbeeld, een set van vier binnenste-labiale kwadrant (IL2Q) neuronen ondergaan uitgebreide omkeerbaar verbouwen tijdens dauer formatie. Gebruik makend van de bekende milieu routes reguleren dauer ingang, een vooraf vastgestelde methode voor de productie van ruw dauer feromoon van grootschalige vloeistof nematode kweken wordt aangetoond. Bij deze methode wordt een concentratie van 50.000 – 75.000 rondwormen / ml vloeibare kweek voldoende is om een ​​zeer krachtige ruwe dauer feromoon. De ruwe feromoon potentie is determined door een dosis-respons bioassay. Ten slotte gebruikt voor in vivo time-lapse imaging van de IL2Qs tijdens dauer vorming methoden beschreven.

Introduction

Fenotypische plasticiteit, met inbegrip van ontwikkelings-en gedragsproblemen plasticiteit, is belangrijk voor de aanpassingen aan de ongunstige omstandigheden en wordt beschouwd als een drijvende kracht in de evolutie ^1. C. elegans is een modelorganisme vaak gebruikt voor onderzoek naar de ontwikkeling en neurobiologie. Onder ideale omstandigheden, C. elegans ontwikkelt zich door vier larvale stadia voorafgaand aan het invoeren van de volwassen reproductieve fase. Echter, onder omstandigheden van lage beschikbaarheid van voedsel en de hoge bevolkingsdichtheid, C. elegans is een ontwikkelings-schakelaar te ondergaan en het aangaan van een lange levensduur en stress-bestendig dauer fase ^2. Dauers tonen verschillende morfologische en gedragsmatige verschillen van niet-dauers die waarschijnlijk bemiddelen deze stressbestendigheid. De omgevingsfactoren en genetische pathways reguleren dauer toegang is uitvoerig beschreven ^{3, 4, 5, 6, 7.} De moleculaire mechanismen die individuele fenotypische veranderingen die optreden dijdens dauer vorming zijn minder goed begrepen.

Het onderzoek van dauer-specifieke fenotypes vereist de productie van dauer dieren. Dit kan op drie manieren: 1) plukken van een uitgehongerd cultuur van C. elegans, 2) Gebruik van dauer vorming constitutieve (daf-c) mutanten, 3) Inductie van dauer vorming door gezuiverd feromoon. Het is relatief eenvoudig om dauers kiezen uit een standaard NGM plaat met een C. elegans bevolking dat de bacteriële voedselvoorziening heeft uitgeput. In onze handen, een standaard NGM plaat oorspronkelijk geënt met 50 ui OP50 Escherichia coli, kunnen groeien gedurende 3 dagen en vervolgens geïnoculeerd met 3-4 volwassen hermafrodieten bewaard bij 25 ° C zal de voedselvoorziening binnen een week uitgeput en produceren duizenden dauers binnen een extra 3 dagen (in aanvulling op tal uitgehongerd non-dauers). Echter, deze methode is onbevredigend voor de behandeling van processen die optreden tijdens de rui in dAuer. Het is moeilijk om te bepalen welke van de enkele duizenden dieren op een typische uitgehongerde plaat zijn het aangaan van dauer. Bovendien wordt het gebruik van een uitgehongerde plaat biedt geen mogelijkheid om te synchroniseren. Het gebruik van daf-c mutanten maakt synchronisatie en betrouwbare generatie dauers. Er is echter geen garantie dat een bepaald daf-c mutatie geen invloed andere dauer-specifieke fenotypes alleen of in combinatie met andere mutaties.

De aanwezigheid van een dauer feromoon werd voor het eerst gesuggereerd door Cassada en Russell en later aangetoond door Golden en Riddle. De dauer feromoon is sindsdien chemisch gekarakteriseerd ^{2, 8, 9, 10.} Het gezuiverde feromoon bestaat uit een complex mengsel van ascarosides, die in verschillende vormen reguleren van gedragsmatige en ontwikkelingsprocessen ^{9, 11.} Toepassing van een ruw extract dauer feromoon maakt betrouwbare gecontroleerde inductie van gesynchroniseerde dauers in een wild-type achtergrond. </p>

Het zenuwstelsel en de bijbehorende gliacellen ondergaan remodeling tijdens dauer larve vorming ^{12, 13, 14.} Sommige van deze veranderingen zijn onomkeerbaar, zoals de verbouwing van gliacellen tijdens dauer ^{13, 14.} Echter andere remodeling gebeurtenissen zijn reversibel na een terugkeer naar positieve omgevingsomstandigheden. Bijvoorbeeld, een set van vier IL2Q neuronen ondergaan snelle en omkeerbare neuronale remodeling in dauer formatie inclusief: dendriet arborization, een omschakeling van enkele dendritische tot multidendritic neuronen en axonen remodeling ^12. De werkwijzen die hierin staan ​​voor een betrouwbare in-vivo beeldvorming van stress geïnduceerde neuroplasticiteit in een modelorganisme. Tot de voor de productie en het testen van ruwe dauer feromoon werkwijzen zijn eerder beschreven en samengevat van verschillende bronnen ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

Protocol

1 Ruwe Dauer feromoonproductie Grow OP50 E. coli van een enkele kolonie O / N bij 37 ° C onder schudden in 100 ml LB-bouillon bij 200 rpm. LET OP: Deze O / N cultuur kan vooraf worden gemaakt en opgeslagen bij 4 ° C. Grow N2 C. elegans op 15-20 juni cm petrischaaltjes met NGM agar (zie recept in tabel 1) geënt met 50 ui OP50 E. coli totdat de bacteriën bijna op 19. Maak 5x 250 ml S media (zie recept in tabel 1) in 1 L erlenmeyers 19. OPM…

Representative Results

De productie van ruwe dauer feromoon resulteert in een gele vloeistof (figuur 1) die zowel warmte en koude stabiel. Hoeveelheden van ruwe feromoon opgeslagen bij -20 ° C onbeperkt zonder duidelijke verlies van activiteit. Na de productie van feromonen, een enkele dosis-respons bioassay is voldoende voor een ruwe schatting van potentie. Voor de meeste experimenten moet de bioassay 2 nogmaals – 3 keer en neem het gemiddelde van elk experiment. Representatieve resultaten van twee feromoon bioassays zijn a…

Discussion

Een onderzoek van dauer-specifieke neuroplasticiteit en andere dauer geassocieerde morfologische veranderingen vereist gecontroleerde en betrouwbare vorming van dauers hetzij door genetische mutatie (dwz daf-c mutanten) of door blootstelling van wildtype dieren feromoon. Hoewel het gebruik van een genetische mutatie te induceren dauers handig kan deze resultaten verwarren. Daarom verzamelde gegevens met daf-c mutaties moet vervolgens worden bevestigd met wild-type dieren veroorzaakte aan de dauer fase …

Materials

N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 mL H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 mL of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 mL of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 mL. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 mL of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 mL, autoclaved), 2.5 mL of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 liter. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 mL of 1 M CaCl2, and 0.75 mL of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 mL of 0.513 M NaCl and 5 µL of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 mL culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 mL.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µL 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µL 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving