Se presenta una informática flujo de trabajo flexible que permite un análisis basado en imágenes multiplexado de las células marcadas con fluorescencia. El flujo de trabajo cuantifica marcadores nucleares y citoplasmáticos y calcula translocación marcador entre estos compartimentos. Se proporcionan procedimientos para la perturbación de las células utilizando siRNA y metodología fiable para la detección de marcadores por inmunofluorescencia indirecta en formatos de 96 pocillos.
Los avances en la comprensión de los mecanismos de control que rigen el comportamiento de las células en modelos de cultivo de tejidos de mamíferos adherentes son cada vez más dependiente de los modos de análisis de una sola célula. Métodos que entregan datos compuestos que reflejan los valores medios de los biomarcadores de las poblaciones de células se arriesgan a perder la dinámica de subpoblación que reflejan la heterogeneidad del sistema biológico estudiado. De acuerdo con esto, los enfoques tradicionales están siendo sustituidos por, o compatibles con formas más sofisticadas de ensayo celular desarrolladas para permitir la evaluación por microscopía de alto contenido. Estos ensayos potencialmente generan un gran número de imágenes de biomarcadores fluorescentes, lo que permitió al acompañar a los paquetes de software propietario, permite mediciones multi-paramétricas por célula. Sin embargo, los costos de capital relativamente altos y el exceso de especialización de muchos de estos dispositivos han impedido su acceso a muchos investigadores.
Descrito aquí es unaflujo de trabajo de aplicación universal para la cuantificación de múltiples intensidades marcador fluorescente de regiones subcelulares específicos de células individuales adecuados para su uso con imágenes de la mayoría de los microscopios de fluorescencia. La clave de este flujo de trabajo es la implementación del software Profiler célula libre disposición 1 para distinguir las células individuales en estas imágenes, segmento que en regiones definidas subcelulares y entregar intensidad marcador fluorescente valores específicos a estas regiones. La extracción de valores de intensidad de células individuales a partir de los datos de imagen es el propósito central de este flujo de trabajo y se ilustrará con el análisis de los datos de control de una pantalla de siRNA para los reguladores de punto de control G1 en células humanas adherentes. Sin embargo, el flujo de trabajo que aquí se presenta se puede aplicar al análisis de datos procedentes de otros medios de perturbación celular (por ejemplo, pantallas de compuestos) y otras formas de fluorescencia basada en marcadores celulares y por lo tanto deben ser útiles para una amplia gama de laboratorios.
El trabajo presentado aquí describe el uso de la Profiler software Cell libremente disponible para realizar desglose algoritmo de guiado de imágenes de microscopía de fluorescencia de las células adherentes para identificar las células individuales y regiones subcelulares definidos. Este enfoque, conocido como segmentación de la imagen, permite el análisis multi-paramétrico posterior de las células fotografiadas mediante la cuantificación de los marcadores marcados con fluorescencia localizadas a cada célula o región subcelular (denominado como objetos segmentados). Este flujo de trabajo es la base para permitir el análisis de alto contenido y está destinado a servir como una herramienta que pueda desarrollarse y modificarse para adaptarse a multiparamétrica, célula individual analiza en laboratorios que no tienen acceso a los instrumentos de alto contenido especializado o software propietario. Los archivos suministrados con este manuscrito se compone de un conjunto de pruebas de datos de imágenes en bruto pertinentes, configuración del algoritmo y scripts de apoyo para generar el análisis descrito. La configuración del algoritmo proporcionado fo Profiler célula están optimizados para el conjunto de datos de ejemplo y los detalles de la sección Discusión qué puede ser necesario ajustar para permitir el uso de datos de imágenes de otros estudios.
Una vez que los datos cuantitativos se ha extraído usando el Perfil de la célula, los diferentes laboratorios pueden tener diferentes requisitos para el uso de la información presentada por los valores de las celdas individuales en los datos en bruto; Aquí se muestra un método por el cual las puertas se aplican a los datos en bruto para cada ensayo. El uso de estas puertas, los datos se transforman en términos binarios de respuesta, permitiendo la visualización de las tendencias enlazan diferentes tratamientos con las subpoblaciones de células que experimentan respuesta definido por las puertas. Las puertas se establecen basándose en observaciones de las distribuciones de datos obtenidos para controles positivos y negativos apropiados para cada medición relevante. El uso de puertas es sólo un ejemplo de cómo manejar las mediciones primas, basadas en células. También se muestra aquí es el uso de la intensidad del ADN nuclear míasurements en su forma cruda como un rango continuo de valores, en combinación con los datos cerrados. Se deben considerar otros enfoques para la gestión de datos de análisis de imagen, dependiendo de la naturaleza del estudio; alternativas estadísticas al uso de puertas para la asignación de las células a las subpoblaciones se han reportado 2 y sistemáticas las comparaciones de estrategias para resumir los datos de alto contenido a través de un gran número de parámetros se han reportado 3.
Análisis de alto contenido de datos de imagen han encontrado uso en estudios celulares de droga-respuesta, revertir la genética y el estrés ambiental señalización 4-6. El mérito de análisis de alto contenido deriva del hecho de que el análisis algorítmico de datos de microscopía de fluorescencia permite que los parámetros cuantitativos y espaciales que deben considerarse simultáneamente a través de las células individuales 7. De esta manera, los resultados celulares para múltiples ensayos pueden ser un comportamiento referencia cruzada, diferencial de ensayo-dsubpoblaciones de células efined pueden ser rastreados en condiciones experimentales y ensayos pueden incluir la consideración de las variables morfológicas. La estrategias y análisis de flujo de trabajo discutido aquí, como para otros enfoques de alto contenido, son capaces de entregar datos multiplexados que son referencias cruzadas a las células individuales. Estudios de alto contenido de métodos traje que generan imágenes de microscopio fluorescente y que son aplicables al análisis de los datos que van desde decenas de imágenes producidas en microscopía basada en fluorescencia convencional de bajo rendimiento a través de las miles de imágenes producidas utilizando plataformas de alto contenido de detección automáticos.
El flujo de trabajo se ilustra aquí con datos de ejemplo de la cual ensayos separados se miden en términos de cualquiera de las intensidades de marcadores fluorescentes nucleares o translocación citoplasmática / nuclear de una proteína fluorescente reportero, respectivamente. El flujo de trabajo es flexible en que estos ensayos se pueden considerar por separado o en combinación dependiendo de EACh dada pregunta de investigación por diferentes investigadores. Los datos de ejemplo se producen como parte de un ARN de interferencia (RNAi) experimento (Figura 1). Oligonucleótidos pequeños ARN de interferencia (siRNA) se utilizan para desmontables proteínas específicas en células de carcinoma colorrectal humano HCT116 que resultan en cambios para dos reporteros fluorescentes de quinasa (CDK) la actividad dependiente de ciclina. La fosforilación CDK6 dependiente de la proteína retinoblastoma nuclear en la serina 780 (P-S780 RB1) se evaluó mediante tinción de anticuerpos. En las mismas células, un reportero de la proteína verde fluorescente marcada de la actividad CDK2 (reportero GFP-CDK2) es evaluada por su relación núcleoicitoplasma donde en ausencia de la actividad de CDK2 el periodista reside en el núcleo y en lanzaderas de activación CDK2 en el citoplasma 8. Además, el ADN nuclear de cada célula se tiñe usando un colorante intercalante de ADN, bisbenzimide, que sirve como un medio para identificar las células y definir las fronteras núcleos en las imágenes así unasa medida de la abundancia de ADN proporcionar información sobre la posición del ciclo celular de la célula (Figura 2).
Las actividades de CDK2 y CDK6 son detectables como células de tránsito de G1 a la fase S del ciclo celular 5 y suceden unos a otros 9,10 y, como tal, se espera que cerca de concordancia entre los dos reporteros en células individuales. El conjunto de datos de demostración utilizado aquí como un ejemplo analiza el efecto de siRNA dirigido a CDK6, la proteína retinoblastoma (RB1) y un control negativo no dirigido (Tabla 1). Desmontables de CDK6 debe obtener tanto una disminución de la RB1 epítopo P-S780 y una acumulación de células en la fase G1 del ciclo celular. La caída RB1 sirve como control reactivo para la especificidad del anticuerpo fosfo-S780. Imágenes de microscopio de fluorescencia de formalina fijos 11, las células de cultivo de tejidos teñidos con fluorescencia HCT116 se utilizan para análisis de imagen algorítmica. Los datos numéricos resultante se utiliza entonces parareferencias cruzadas a los reporteros y medir el impacto de los diferentes estados de derribo.
El tamaño potencial de los datos producidos por este tipo de análisis puede presentar un desafío para las herramientas de análisis normales. Por ejemplo, los datos de las celdas individuales pueden ser mayores que un cierto software de hoja de cálculo tendrá en cuenta. Incluido son scripts de Perl que realizan el procesamiento simple, altamente repetitivo, supervisado de los datos para facilitar el análisis de grandes conjuntos de datos. Los scripts de Perl están escritos específicamente para los archivos de salida producidos por la célula de perfiles, al procesar archivos de imagen con una denominación de archivos específico (Figura 3), y permiten un número variable de campos por pocillo para ser utilizados en el análisis. Con frecuencia es importante a los datos de ensayo de célula individual puerta para rastrear las tendencias en las subpoblaciones de células 5 y se muestra aquí es el uso de un script Perl para marcar cada célula sobre la base de una puerta conjunto predeterminado para cada tipo de ensayo. También se incluyen los scripts de Perl opcionalesque resumen los resultados de datos para los pozos individuales (o condiciones), la entrega de: porcentaje de células dentro de la puerta de conjunto y los valores medios de las puntuaciones de ensayo primas. La forma última, más homogénea de la visualización de los datos, es válido que las respuestas afectan a la totalidad o la mayoría de las células dentro de un pozo. Como se discutió anteriormente, dicha evaluación es menos útil que la proporcionada por el gating datos célula individual donde la respuesta se limita a un subconjunto de células dentro de una población.
La utilidad del flujo de trabajo descrito no se limita a la perturbación por siRNA o los ensayos de marcadores descritos. Los estudios han usado este enfoque para ensayar respuestas en experimentos de cultivo de tejidos que utilizan combinaciones de siRNA, inhibidores químicos y tratamiento de radiación y para la evaluación de marcadores distintos de la actividad de CDK2 y CDK6 5.
Conceptualmente, la estrategia experimental permite una variedad de regiones subcelulares biológicamente útiles que se registra automáticamenteen las células individuales presentes en las imágenes de microscopio de fluorescencia. Como tal, este enfoque puede dar datos multiplexados revelar información cuantitativa, biológicos que pueden ser ignorados a través de técnicas que se centran en las poblaciones en lugar de las células individuales. Con modificaciones menores, el enfoque y el análisis de flujo de trabajo descrito se puede producir, datos celulares individuales cuantitativos para las salidas de ensayo basado en fluorescencia y respuestas de células biológica, donde la evaluación cuantitativa del contenido de ADN, la cuantificación de la fluorescencia nuclear o citoplásmica o la shuttling de los marcadores entre estos dos compartimentos ya sea individualmente o en forma multiplexada es de interés. Como requisitos de publicación tienden cada vez más a la presentación de los datos en bruto en acceso abierto, el acceso y la familiaridad con herramientas libres para el análisis de imágenes de microscopía, como los descritos aquí también será de interés directo para los laboratorios que buscan volver a analizar los datos publicados.
El flujo de trabajo descrito constituye un procedimiento para la perturbación de múltiples pocillos de células utilizando siRNA, la detección de marcadores posterior y finalmente uso de una serie de pasos de software soportado para facilitar la extracción de los datos cuantitativos de las imágenes de microscopía fluorescente resultantes. El enfoque se centra en la entrega de valores de intensidad nucleares y citoplasmáticas de las células individuales, que tiene una amplia aplicación práctica en muchas aplicaciones basadas en células. Los datos de ejemplo utilizados aquí se generaron en un ajuste de la pantalla siRNA en el que dos ensayos fluorescentes para el tránsito del ciclo celular en fase G1 se prueban y se correlacionan de nuevo a una medida más directa biofísico del contenido de ADN nuclear.
El uso de una mancha de ADN fluorescente de ADN nuclear imagen es un paso indispensable en el proceso de segmentación de imágenes, ya que permite la identificación de células individuales y la resultante 'Núcleos máscara' sirve como el punto de partida para identificar correspondiente cytoplasmiregiones c. El reportero CDK2 GFP-etiquetados, que se expresa de forma estable en las células, da una variable todavía consistentemente más alta que la señal de fondo en el citoplasma por la cual este compartimiento se puede delinear. El mismo análisis de tuberías debe ser aplicable al análisis de los eventos de translocación de proteínas utilizando otros reporteros de fluorescencia ligada adecuados y su respuesta a la perturbación. Además, sustituyendo el reportero GFP-CDK2 con tintes fluorescentes-citoplasma específica permitiría el uso alternativo de este algoritmo para medir las dimensiones del citoplasma y los tamaños relativos de las células en las imágenes.
Otra consideración de diseño en la estrategia de segmentación de imagen descrito aquí es el uso de la célula de perfiles para ofrecer valores de intensidad integrados para la cuantificación de ADN. Integración de la intensidad de valores para los datos de tinción de ADN nuclear permiten posibles variaciones en el tamaño núcleo, y representa una coincidencia cercana para los perfiles de cuantificación vistopara yoduro de propidio manchado FACS datos. Sin embargo, la intensidad integrada no puede proporcionar un medio adecuado para evaluar la función de la proteína donde la concentración media, ejemplificada por la intensidad media de fluorescencia antígeno, es biológicamente más relevante que la cantidad total integrado de proteína (y fluorescencia asociada) dentro de un compartimento celular. Por lo tanto significan valores de intensidad se utilizaron para la P-S780 RB1 y los datos GFP. La opción para alterar entre los dos modos (media o integrado) de la evaluación de los datos se encuentran en el panel 'ExportToSpreadsheet' del software Profiler célula.
Los ajustes de análisis en el archivo 3_channels_pipeline.cppipe están optimizados para las imágenes en el conjunto de datos de ejemplo. Análisis de nuevas imágenes conjuntos con este protocolo, será necesario que los nombres de archivo adoptan la convención de nombres descrita anteriormente (Figura 3). Además, la sensibilidad valora adecuada a la luminosidad de la tinción de ADN nuclear y umbrales para el fondointensidades en los nuevos conjuntos de imágenes pueden necesitar ser ajustado dentro de la configuración del analizador Cell. Dado el papel clave de la tinción de ADN se mantiene para la construcción de las diversas máscaras de segmentación de imágenes, la aplicación de ajustes de sensibilidad correctos para este canal es clave para el análisis exitoso de nuevos datos de la imagen con el software Profiler Cell. El archivo de configuración proporcionado Profiler celular (3_channels_pipeline.cppipe) contiene notas sobre los parámetros más útiles para adaptar el análisis de nuevos datos. Estas notas están en el cuadro de texto en la parte superior de la pantalla en la ventana principal de Profiler celular e incluyen una guía sobre cómo cambiar los ajustes de sensibilidad y ajustar el número de canales a analizar. Como acusado en la sección Protocolo 2.8, para probar la configuración de los nuevos datos de la imagen puede ser necesario para observar la segmentación de imágenes durante el análisis de la imagen haciendo clic en Abrir los iconos de "ojo" para cada uno de los 'Identificar … Objetos' pasos del protocolo (Figura S1D </strong>). En particular, la visualización de los datos de imagen a través de 'IdentifyPrimaryOjects' mostrará si la máscara núcleos se identifica correctamente a partir de imágenes de la tinción de ADN. En la página de software Profiler célula para módulo de los 'IdentifyPrimaryOjects' es el factor de corrección umbral. Ensayo y error de ajuste de este valor se solucionará la mayoría de los errores de reconocimiento nucleares. Los valores de balance del canal de ADN contra la intensidad de fondo para cada imagen. Los valores del factor de corrección Umbral giran en torno a 1, donde mayor que este es más riguroso (bueno para imágenes claras) y menos de 1 El indulgente (adecuado para imágenes con menos contraste entre las manchas y fondo).
La salida de los datos en bruto de células individuales de Profiler célula puede ser analizado en diferentes maneras para adaptarse a las necesidades de los otros estudios. Aquí se muestra el uso de un script Perl para aplicar puertas a dos de los parámetros medidos por célula con el fin de ayudar a la extracción de las tendencias biológicas de la una de datosd permiso de referencias cruzadas de las subpoblaciones identificadas con medidas adicionales. Aunque también es posible incluir elementos de compuerta en el marco de Profiler célula, la ruta alternativa utilizada aquí proporciona una mayor flexibilidad y rapidez, especialmente si grandes conjuntos de datos deben ser evaluados. La etapa más lenta en las fases de adquisición posterior de las imágenes del protocolo actual es la ejecución del software Profiler célula. Perfilador Cell aquí se ejecuta sin imponer puertas para producir un conjunto de datos en bruto no-cerrada que puede ser reanalyzed con el script Perl posterior más rápida y, si es necesario, de forma iterativa con valores diferentes de puerta. No todos los estudios sabrán de antemano los valores de compuerta adecuados como esto puede variar con los reactivos en cualquier conjunto dado de datos, y potencialmente con el tiempo. Es, por tanto, se recomienda para generar histogramas que representan la distribución de los datos en bruto obtenido a partir de perfiles de la célula para los controles positivos y células maqueta perturbados con el fin de identificar Valu puerta adecuadaes para los parámetros de interés.
Los scripts de Perl se escriben a aceptar una estructura de columnas definidas rígidamente de datos de perfiles de la célula y puede dejar de funcionar si un usuario modifica el número de parámetros de salida por Profiler célula usando las configuraciones del 'ExportToSpreadsheet'. Para ayudar a implementar la modificación de la configuración de las notas se incluyen dentro de los archivos de script de Perl. Para ver estos ver la secuencia de comandos en un editor de texto, preferiblemente editor de texto para programadores de Perl establece en elementos de código de color (por ejemplo, http://www.activestate.com/komodo-edit). Estas notas indican dónde ajustar la secuencia de comandos para adaptarse a los cambios de formato de datos. De manera similar a los scripts de Perl, el archivo de código R proporcionado (analysis.r), que contiene las instrucciones para el trazado de las cifras de los datos de análisis de imagen, se puede leer en un editor de texto o software RStudio ver notas adicionales sobre el uso y la adaptación. Estas notas pueden ser complementados con información detallada sobre expresiones regulares y Perl <sup> 12 y el paquete ggplot2 13 para R, los cuales forman la base de cómo se leen los datos, anotado y se representa, respectivamente.
Nuevos estudios utilizando microscopía de fluorescencia, así como datos brutos depositados en las publicaciones de código abierto son susceptibles a métodos de análisis tales como los descritos aquí. La propia naturaleza de los datos de alta contenido se presta para el análisis recursivo con diferentes énfasis analíticos en función de los intereses de investigación de cualquier observador dado. Aunque las preguntas que se pueden hacer de los datos están limitados por las sondas utilizadas originalmente, los datos de imagen a menudo pueden ser significativamente volvieron a analizar más allá del ámbito de los estudios que los generaron.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por becas CRUK 15.043 y 14.251 CRUK.
Damos las gracias a Daniel Wetterskog y Ka Kei Ho para la asistencia técnica y la lectura crítica del manuscrito.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
AllStars negative control siRNA | Qiagen | 1027280 | Negative control siRNA. |
CDK6 siRNA | Dharmacon/ Custom synthesis | NA | Antisense sequence: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU |
RB1 siRNA | Dharmacon/ Custom synthesis | NA | Antisense sequence: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT |
5x siRNA buffer | Thermo Scientific | B-002000-UB-100 | To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water. |
Nulcease-free water (non-DEPC) | Applied Biosystems | AM9937 | For dilution of siRNA buffer. |
Hiperfect | Qiagen | 301705 | Transfection lipid. |
DMEM | Life Technologies | 41966052 | Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media. |
96 well tissue culture plate | Falcon | 3072 | Plain, 96-well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes. |
Packard Viewplate | Perkin Elmer LAS | 6005182 | 96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates. |
Breathable membrane | Alpha Labs | LW2783 | Sterile, gas-permeable, adhesive membrane. |
Neutral buffered formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT5012-1CS | 10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100PC | Non-ionic detergent |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | For plate wash solution. |
Anti-P-S780 RB1 antibody | Abcam | ab32513 | Rabbit monoclonal |
AlexaFluor647 Anti-rabbit | Invitrogen | A21245 | Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody. |
Hoechst 33342 (Bisbenzimide) | Sigma-Aldrich | B2261 | Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye. |
Permeabilization solution | NA | NA | 0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0. |
Plate wash solution | NA | NA | Tris-buffered saline containing 0.1 % Tween-20. |
Block solution | NA | NA | 5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies. |
Cell Profiler 2.1 | Broad Institute | http://www.cellprofiler.org/download.shtml | |
Active Perl Community Edition | ActiveState | http://www.activestate.com/activeperl/downloads | |
R programming environment | The R Foundation | http://www.r-project.org | |
Rstudio | Rstudio | http://www.rstudio.com/ |