Rene Rigenerazione in Zebrafish adulti da Gentamicina Induced Injury
Summary
Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.
Abstract
The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.
Introduction
Il rene è essenziale per l'omeostasi del fluido, la regolazione della pressione sanguigna e la filtrazione dei rifiuti dal corpo. Anche se i mammiferi sono in grado di riparare i nefroni esistenti dopo la lesione utilizzando cellule epiteliali differenziate 1-4, sembrano mancare di un pool di cellule staminali riservati 5 e sono in grado di formare nuovi nefroni de novo. A differenza dei mammiferi, i pesci adulti sono in grado di formare nuovi nefroni per tutta la vita adulta per sostenere la crescita del pesce e in risposta al danno 6,7. Il zebrafish, Danio rerio, è un organismo modello prezioso per lo studio della rigenerazione degli organi 8-10 e ha il potenziale per fornire potenti intuizioni in applicazioni per l'ingegneria la riparazione di reni umani. Il Tg (Lhx1a: EGFP) transgene 11 ha dimostrato di etichettare un pool di cellule progenitrici nephron in zebrafish adulti rene 12, tuttavia i meccanismi che controllano la risposta delle cellule lhx1a + al danno rEmain chiaro.
La gentamicina aminoglicoside è un antibiotico ampiamente usato con noti effetti nefrotossici e ototossici nell'uomo 13. Iniezione intraperitoneale di gentamicina è un metodo consolidato di indurre danno renale acuto nei pesci 6. Questa lesione nel pesce imita la perdita dell'epitelio tubolare e cicatrici di glomeruli che si verifica negli esseri umani dopo gentamicina sovradosaggio 14. Indurre lesioni in zebrafish per iniezione gentamicina è un modo conveniente di indurre una forte risposta rigenerazione sincrono, con molti nuovi nefroni prodotte e, contemporaneamente, di procedere attraverso le fasi di formazione, la proliferazione e la differenziazione.
Dettagli Questo protocollo il nostro metodo per lesioni robusto e riproducibile in zebrafish adulti rene utilizzando un processo di screening non invasivo visivo per ridurre al minimo i valori anomali. Approfittiamo del fatto che il pregiudizio con gentamicina porta alla morte del tessuto renale epiteliali e formatoioni di calchi tubulari renali, che poi si accumulano in masse nei condotti mesonefrici e cloaca. Questi sono passati dai pesci e possono essere osservati visivamente in acqua. Questo ci permette di schermo per il pesce con forte infortunio non letale, che può essere messo in comune per ulteriori sperimentazioni. Minimizzare il numero di pesci illeso o pesce che muoiono prima di raggiungere il punto finale dell'esperimento porta a più uniforme ed efficiente la raccolta di dati e di analisi. Inoltre, non sono richiesti particolari dispositivi o reagenti, rendendo questo metodo conveniente e adatto per l'uso in un ambiente accademico o di insegnamento. Utilizzando il nostro metodo, qui mostriamo effetti sempre maggiori delle dosi gentamicina sulla rigenerazione del rene, nonché l'effetto di aumento della temperatura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il pesce zebra è ideale per studiare la rigenerazione di organi adulti tra cui il rene mesonefrico 6 adulti. Recenti studi hanno approfittato di marcatori molecolari e nuove linee giornalista transgenici per caratterizzare meglio i passaggi che si verificano durante la rigenerazione nefrone e quali le cellule potrebbero essere responsabili 7,12. Osservazione di calchi urinari è stata utilizzata da più di un secolo per diagnosticare la malattia del rene nell'uomo 16. Qui si usa la …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant F32DK091998 to CNK; NIH grant RO1DK041071 and Harvard Stem Cell Institute grant D001229 to IAD. The authors thank Neil Hukriede for the lhx1ain situ probe.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| gentamicin sodium sulfate | Sigma | G1264 | TOXIC, purity varies from batch to batch |
| plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | |
| 1 ml Norm-Ject syringes | Electron Microscopy Sciences | 72520 | green plastic syringes, ordinary 1ml syringes are OK, but harder to read accurately |
| 30G1/2 needles | Becton Dickinson | 305106 | |
| ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) | Sigma | A5040 | IRRITANT |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make 4% in 1xPBS for working solution |
Referencias
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