Summary
A glândula lacrimal (LG) é um órgão de ramificação que produz os componentes aquosos de lágrimas necessários para a manutenção da visão e saúde ocular. Aqui nós descrevemos murino LG dissecção e ex vivo de técnicas de cultura de decifrar as vias de sinalização envolvidas na LG desenvolvimento.
Abstract
A glândula lacrimal (LG) segrega lágrimas aquosas necessárias para a manutenção da estrutura e função da córnea, um tecido transparente essencial para a visão. No ser humano uma única LG reside na órbita acima da extremidade lateral de cada olho entregar lágrimas para a superfície ocular através de 3-5 condutas. O rato tem três pares de glândulas oculares, a mais estudada de que é a glândula lacrimal exorbital (LG) anterior localizado e ventral ao ouvido. Semelhante a outros órgãos glandulares, o LG desenvolve através do processo de epitelial morfogénese de ramificação em que um único broto epitelial dentro de um mesênquima condensada é submetido a vários ciclos de gema e formação adesiva para formar uma intrincada rede interligada de ácinos secretora e condutas. Este processo elaborado tem sido bem documentado em muitos outros órgãos epiteliais, tais como o pâncreas e glândulas salivares. No entanto, a LG tem sido muito menos explorado e os mecanismos que controlam a morfogênese são mal sobse levantou. Suspeitamos que essa sub-representação como um sistema modelo é uma conseqüência das dificuldades associadas com a descoberta, dissecando e cultivando a LG. Assim, aqui descrevemos técnicas de dissecação para a colheita embrionário e pós-natal LG e métodos para a ex vivo da cultura do tecido.
Introduction
A glândula lacrimal (LG) é responsável pela secreção de lágrima aquosa crítica para a acuidade visual e a saúde, a manutenção e a protecção das células da superfície ocular. LG resultados disfunção em um dos distúrbios oculares mais comuns e debilitantes: doença de olho seco deficiente aquosa, o qual é caracterizado por irritação ocular, sensibilidade à luz e uma visão diminuída. No ser humano o LG reside na órbita acima da extremidade lateral do olho onde 3-5 excretores lágrimas condutas de depósito sobre a superfície ocular. O rato tem três pares de glândulas oculares, a mais estudada de que é a glândula lacrimal (LG) anterior localizado e ventral ao ouvido (exorbital) com lágrimas que viajam para o olho através de um único canal excretor. Semelhante a outros órgãos glandulares, a LG desenvolve através do processo de morfogênese epitelial ramificação em que um único broto epitelial dentro de um mesênquima condensado passa por várias rodadas de broto e formação de duto para asou uma intrincada rede interligada de ácinos e ductos de secreção (Figura 1) 2. Durante o desenvolvimento do epitélio torna-se vascularizado, bem como fortemente inervados por nervos parassimpáticos do gânglio pterigopalatina e, em menor grau pelos nervos simpáticos do gânglio cervical superior 3. As interacções entre as células de cada um destes tipos de células neuronais ou seja, epiteliais, endoteliais e mesenquimais, são essenciais para a função e manutenção do tecido adulto. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes coordenação LG desenvolvimento e regeneração, bem como a forma como tipo de comunicação inter-celular orienta esses processos ainda não está claro.
O advento das embrionárias ex vivo técnicas de cultura permitiu a identificação de vias de desenvolvimento e regeneração em vários órgãos de ramificação 4. A cultura ex vivo dá o pesquisador a capacidade de manipular o órgão (memecânica, química ou genética) sob condições definidas, bem como para caracterizar o desenvolvimento de órgãos e as interacções célula-célula em tempo real. A LG exorbital do mouse é altamente favorável a esta técnica e estudos recentes têm definido sistemas que regulam seu desenvolvimento 2,5 sinalização. No entanto, apesar da necessidade de entender sinais moleculares subjacentes LG desenvolvimento e regeneração, que atualmente permanece pouco estudado, provavelmente devido às dificuldades técnicas de isolamento do órgão. Neste artigo, descrevemos como isolar e executar ex vivo da cultura do embrionário murino LG para definir programas de desenvolvimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
A versatilidade de cultura e manipular o LG ex vivo proporciona vantagens significativas para estudar o seu desenvolvimento. Isto inclui a velocidade a que o pesquisador é capaz de testar hipóteses e a multiplicidade de perturbações que podem ser realizados para avaliar a forma como epitelial, neuronais, células endoteliais e mesencyhmal interagem para formar o órgão. No entanto, há um número de advertências para a utilização deste modelo. Em primeiro lugar, em virtude de seu isolamento a glândula …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer financiamento concedido pelo Programa de Alocação de Recursos UCSF.
Materials
| Name | Catalog #. | Company | Comments/Description |
| DMEM/F12 without HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicillin-Streptomycin | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albumin solution from bovine serum | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Paraformaldehyde 16% Solution | 15710 | Electron Microscopy Sciences | Diluted to 4% in 1X PBS |
| Phosphate Buffered Saline 10X | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Phosphate Buffered Saline 1X | Prepared from 10X stock | ||
| holo-Transferrin bovine | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL. |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL. |
| BioLite 100mm Tissue Culture Treated Dishes | 130182 | Thermo Scientific | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo Microscope with substage iluminator | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| Substage Illuminator Base for Stereo Microscope | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35mm Tissue Culture Treated Dishes | 353001 | Corning | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50mm uncoated glass bottom dishes | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Widefield fluorescence microscope | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal Microscope | TCS SP5 | Leica Microsystems | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Ideal for harvesting glands from embryos | |||
| SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (USA), Inc. | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12 |
| Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 um pre size, 13mm | 110405 | Whatman | |
| Timed-pregnant Pax6-Cre,GFP mice | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Optional mice for learning how to locate the LG. |
Referencias
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