대사 프로파일의 실시간 분석<em> 전의 VIVO</em> 마우스 장내 크립트 Organoid 문화
Summary
소장 토굴 organoids 줄기 세포와 그 틈새에 의존 소낭의 성장을 되풀이 조직 배양 시스템을 제공하는 생체 외 배양. 우리는 기본 마우스 토굴 organoids에 실시간으로 대사 프로파일을 분석하는 방법을 설립했다. 우리는 organoids 자신의 소스에 의해 정의 된 생리 학적 특성을 유지했습니다.
Abstract
소장 점막은 두 가지 기본적인 구조로 구성 반복적 인 구조 전시 : 융모, 장 내강으로 돌출 성숙 장 세포, 술잔 세포와 enteroendocrine 세포 구성을; 및 점막하 근육 판과, 은닉 성체 줄기 및 전구 세포 및 성숙한 Paneth 세포 근위뿐만 아니라 간질과 토굴 미세 환경의 면역 세포를있는 소낭. 지난 몇 년 전까지의 소장 시험 관내 연구에서 양성 또는 악성 종양 중 하나로부터 유래 된 세포주로 제한하고, 정상적인 장 상피의 생리 상주하는 미세 환경의 영향을 나타내지 않았다. 여기서 우리는 사토 등의 알에서 적응하는 방법. (2009) C57BL / 6 마우스에서 파생 된 기본 마우스 장 토굴 organoids을 배양를 보여줍니다. 또, 측정에 의해 실시간으로 토굴 대사 프로파일을 분석하는 토굴 organoid 배양의 사용을 제시기저 산소 소비, 당분 레이트, ATP 생산 및 호흡 능력, 표준. Organoids는 소스에 의해 정의 된 속성을 유지하고 산소 소비와 세포 외 산성화 속도에 의해 반사 된 대사 적응의 측면을 유지합니다. 이 토굴 organoid 문화 시스템에서 실시간 대사 연구는 토굴 organoid 에너지 대사를 연구하는 강력한 도구이며, 어떻게이 영양과 약물 학적 요인에 의해 변조 될 수 있습니다.
Introduction
대장 암 (CRC)는 미국에서 암 관련 사망 원인 중 3 위를 차지한다. 산발적 인 대장 암은 – 즉 인생의 뒷부분에서 발생하는 (> 50 세)와 명확한 걸리기 유전 적 요인과 -를 차지하고 ~ 강하게 장기식이 패턴 1, 2에 의해 영향을 발생으로 모든 경우의 80 %. 이 종양은 종양 세포의 증식 3-5의 높은 비율을 허용 아마도 운전하는 부분 (glutaminolysis을 통해) 사용 가능한 휴대 빌딩 블록과 에너지의 높은 농도를 만들 수 바르 부르크 효과로 알려진 산화 적 해당 작용에 대한 의존도를 향한 신진 대사 변화를, 전시 . 소장 암을 포함하여 대장 암에 대한 연구뿐만 아니라 다른 위장관 암 종양 형성의 원인으로 중요 통찰력을 제공. 탐지를 도울 수있다 위장 기관계의 정상 친 종양 및 종양 상태 사이의 차이를 조사 대사종양 발생에 대한 상대 위험뿐만 아니라 종양의 조기 발견 ermination. 또한, 미토콘드리아의 호흡과 당분을 포함하는 생체 에너지 대사를 이해하는 것은 세포 생리학, 노화 및 질병 상태가 장내 항상성을 교란하는 방법에 근본적인 통찰력을 제공 할 것입니다. 세포 외 플럭스 분석을위한 생체 에너지 분석 기술의 활용이 실시간으로 6,7 문화에서 성장 세포에서 동시에 미토콘드리아 호흡과 당분의 비율을 평가할 수 있습니다.
최근까지 소장의 시험 관내 연구는 양성 또는 악성 종양 중 -8,9- 유래 세포주에 한정되었고, 정상적인 장 상피의 생리 상주하는 미세 환경의 영향을 나타내지 않았다. 2009 년, 사토 등. (10)는 체외 배양 3 차원 (3D) 마우스 장내 상피 organoids를 성장 시스템, 또는 epith 소개실험 진단 및 치료 연구 (10, 11)에 적합 elial "미니 용기". 또한, 열량 제한 쥐에서 분리 된 납골당은 문화 12 organoids 그들의 변화된 성장 특성을 유지한다. 형질 전환 된 세포주에 비해 토굴 organoid 배양 생체 상태를 이해하기 위해 훨씬 더 좋은 모델을 제시 생리 관련 데이터를 생성하는데 사용될 수있다.
우리는 장 토굴 organoids의 에너지 대사를 분석하는 생체 에너지 분석 기술을 적용. 마우스 장 토굴 organoids 제시 토굴 organoid 에너지 대사 연구 개발에 체외 배양 하였다. 산소 소비 속도 (OCR) 및 굴 organoids의 세포 외 산성화 레이트 (ECAR)가없는 두 개의 다른 대사 억제제 (oligomycin, 로테 논) 및 이온 담체 (보닐 시안화 메틸 -p- trifluoromethoxyphenylhydrazone)의 존재하에 측정 하였다. 토굴 ORGA이러한 화학 물질에 솔레노이드 대사 반응은 성공적으로 변화 ECAR 및 OCR 값을 반영했다.
셀룰러 바이오 에너지 연구는 암, 비만, 당뇨병, 대사 장애 및 미토콘드리아 질환 신진 대사 상태와 질병 위험과 표현형 사이의 상호 작용을 규명하고 병진 의학에 대한 직접적인 영향은 사전 심사 방법을 도움이 될 것입니다. 여기에, 우리는 상세한 프로토콜 소장 납골당을 분리하고 문화 토굴 organoids의 정보는 다음의 제품에 대해 설명합니다. 또한, 우리는 대사 분석을 위해 토굴 organoid 문화를 사용하는 새로운 방법을 소개합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 기저 속도 측정 후, 토굴 대사가 oligomycin, 카르 보닐 시아 나이드를 첨가하여 평가 하였다. 산소 소모율 (OCR) 및 8 개월 된 마우스로부터 단리 organoids 체외로 성장 소낭의 세포 외 산성화 레이트 (ECAR)를 테스트 순차적으로 -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)와 로테 논,.
29 분 (그림 2A와 2B) – 기저 OCR 및 기초 ECAR은 0에서 기록되었다. 29 일 분…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)에서 보조금 RO1 CA 135561, R01 CA151494, R01 CA174432 및 P3013330에 의해 지원되었다.
우리는 토굴 격리 프로토콜 개발에 소중한 의견을 미셸 휴스턴, 엘레나 Dhima 박사 안나 Velcich에게 감사의 말씀을 전합니다.
우리는 또한 직접 각각 해마 시설을 운영하는 당뇨병 교육 및 NIH P60DK20541 지원 의학의 알버트 아인슈타인 대학의 연구 센터 박사 마이클 브라운 리 박사와 슈 리앙 뒤를, 감사합니다.
Materials
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free | BD Biosciences | 356231 | |
| PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2 | Life Technologies | 20012-027 | |
| Advanced DMEM/F-12 (1X) | Life Technologies | 12634-028 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium without glucose, L-glutamine, Phenol Red, sodium pyruvate and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma-Aldrich | P4758 | Final Concentration 15 mg / L in DMEM (D5030) – step 2.2.2 |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X, 100ml | Life Technologies | 15240-062 | Final Concentration 1 X or 2 X |
| Penicilin-Streptomycin, liquid | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration 1 X |
| Gibco® GlutaMAX™ supplement | Life Technologies | 35050061 | Final Concentration 1 X |
| Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Final Concentration 10 mM |
| N-Acetyl-L-Cysteine, 25g | Sigma-Aldrich | A9165-25G | Final Concentration 1 mM |
| 100X N-2 supplement, liquid | Invitrogen | 17502-048 | Final Concentration 1 X |
| 50X B-27® supplement minus Vitamin A, liquid | Invitrogen | 12587-010 | Final Concentration 1 X |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50ug | R&D Systems | 3474-RS-050 | Final Concentration 500 ng / mL |
| Recombinant Murine EGF, 100ug | Peprotech | 315-09 | Final Concentration 50 ng / mL |
| Recombinant Murine Noggin, 20ug | Peprotech | 250-38 | Final Concentration 100 ng / mL |
| Gibco® L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Final Concentration 2 mM |
| Gibco® Glucose powder | Life Technologies | 15023-021 | Final Concentration 5 mM |
| Ambion® 0.5 M EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0 | Life Technologies | AM9260G | Final Concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8 |
| DTT (Dithiothreitol), 1M | Life Technologies | P2325 | Final Concentration 3 mM |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | 0.1 % in PBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | 1 % in PBS |
| Recovery™ Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| ROCK inhibitor (Y-27632) | Sigma-Aldrich | Y0503 | Final Concentration 10 µM |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | Final Concentration 1 µM |
| Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | Final Concentration 1 µM |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Final Concentration 1 µM |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Final Concentration 0.1 N in PBS |
| XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer) | Seahorse Bioscience |
Referencias
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