إصابة الأوعية الدموية بالون والإدارة داخل اللمعة في الجرذ الشريان السباتي
Summary
يستخدم هذا البروتوكول قسطرة البالون ليسبب إصابة داخل اللمعة على الشريان السباتي الفئران والآن فصاعدا حصول تضخم neointimal. هذا هو نموذج راسخة لدراسة آليات إعادة الأوعية الدموية في استجابة لإصابات. كما انها تستخدم على نطاق واسع لتحديد صحة النهج العلاجية المحتملة.
Abstract
تم تأسيس البالون نموذج إصابة الشريان السباتي في الفئران جيدا لأكثر من عقدين من الزمن. ويبقى وسيلة هامة لدراسة الآليات الجزيئية والخلوية العاملة في الأوعية الدموية فقد التمايز العضلات الملساء، وتشكيل neointima وإعادة الأوعية الدموية. الذكور سبراغ داولي الفئران هي في معظم الأحيان يعملون الحيوانات لهذا النموذج. لا يفضل إناث الفئران كما الهرمونات الأنثوية هي وقائية ضد أمراض الأوعية الدموية، وبالتالي إدخال الاختلاف في هذا الإجراء. أصيب الشريان السباتي الأيسر عادة مع السباتي الأيمن تخدم كوسيلة لمراقبة سلبية. سبب ترك إصابة الشريان السباتي من قبل بالون منتفخ أن يجرد البطانة وانتفخ الصورة جدار الوعاء الدموي. بعد الإصابة، والاستراتيجيات العلاجية المحتملة مثل استخدام مركبات الدوائية وإما الجينات أو نقل shRNA يمكن تقييمها. عادة لجينة أو نقل shRNA، وtransduced قسم الجرحى من التجويف سفينة محليا لمدة 30 دقيقة مع الخامسالجسيمات iral ترميز إما بروتين أو shRNA للتسليم والتعبير في جدار الوعاء الدموي المصاب. Neointimal سماكة يمثلون خلايا العضلات الملساء الوعائية التكاثري القمم عادة في 2 أسابيع بعد الإصابة. ويتم حصاد السفن في الغالب على هذه النقطة الوقت لتحليل الخلوي والجزيئي للمسارات الإشارات المحمولة، فضلا عن الجينات والبروتينات التعبير. ويمكن أيضا أن تحصد السفن في نقطة زمنية سابقة لتحديد بداية التعبير و / أو تفعيل بروتين أو مسار محدد، اعتمادا على أهداف تجريبية المقصود. ويمكن وصف السفن وتقييمها باستخدام تلطيخ النسيجي، المناعية، المقايسات البروتين / مرنا، والمقايسات النشاط. الشريان السباتي الأيمن سليمة الشريان من نفس الحيوان هو الرقابة الداخلية مثالية. التغييرات الناجمة عن الإصابة في المعلمات الجزيئية والخلوية يمكن تقييمها من خلال مقارنة الشريان المصاب إلى الشريان السيطرة الصحيح الداخلي. وبالمثل، وطرائق علاجية يمكن تقييمها من خلال مقارنة اصابهد وتعامل الشريان إلى الشريان الوحيد السيطرة بجروح.
Introduction
القسطرة البالونية الأجهزة الطبية التي تستخدم في إجراء قسطرة، لغرض توسيع الموقع إعاقة (ق) العصيدة الشريانية أو خثرة في الأوعية الدموية. يتم فرض التجويف السفينة ضاقت لفتح من قبل بالون منتفخ، وسوف يتم استعادة تدفق الدم بشكل تسلسلي للتخفيف من أعراض نقص التروية المصب، مثل الذبحة الصدرية واحتشاء عضلة القلب، وألم في الساق. ومع ذلك، تضاءلت النجاح الكبير الذي حققته الاوعية الدموية التي كتبها مضاعفات ما بعد الجراحة مثل نتائج من القوة مما تسبب الضغطي الأوعية الدموية (إصابة البالون)، وهي جدار الوعاء الدموي إعادة وفي كثير من الحالات إعادة تضييق للسفينة التجويف (عودة التضيق) 1.
وقد تم تطوير عدد من النماذج الحيوانية محاكاة إجراء قسطرة لمساعدة المحققين فهم الآليات الكامنة وراء المتعلقة منطاد إصابة الأوعية الدموية جدار إعادة عرض 2. ومن بين جميع أنواع الحيوانات المستخدمة لنمذجة، الفئران هو الأكثر استخداما. Compared إلى الأرانب والكلاب والخنازير، ومزايا الفئران هي تكلفتها المنخفضة، وسهولة النسبية استخدامها والمعرفة الحالية لعلم وظائف الأعضاء الفئران. على الرغم من أن الفئران لديها ميزة إضافية في مجموعة واسعة من سلالات التلاعب بها وراثيا، السفينة الفئران صغيرة جدا لادخال قسطرة البالون. على مدى العقود الثلاثة الماضية، وقد سمحت فئران التجارب الباحثين لاكتساب فهم أفضل للآليات الجزيئية والخلوية التي تدعم تشكيل neointima والأوعية الدموية إعادة عرض 3-6. ما وراء إصابة البالون، وتشارك إعادة الأوعية الدموية أيضا في معظم الأمراض الأوعية الدموية الرئيسية، مثل تصلب الشرايين 7،8 وارتفاع ضغط الدم 9، وتمدد الأوعية الدموية 10. وهكذا، المعرفة المكتسبة من خلال نموذج إصابة البالون هو بشكل عام مفيد للدراسات مرض جدار الأوعية الدموية بشكل عام.
ويتمثل الهدف العام من طراز إصابة البالون الفئران ليست فقط لمزيد من فهم أمراض الأوعية الدموية ولكن أيضا لاختبار فعالية من وكلاء رواية لمكافحة الأمراض 11،12. يتم تطبيق الحالية العلاج من تعاطي المخدرات السريرية لعودة التضيق بواسطة الدعامات المخدرات يبلغ حجمه وضعت عن طريق التجويف السفينة مباشرة بعد الاوعية الدموية. في النماذج الحيوانية، فعال بعد أكثر اقتصادا الطريق لاختبار عامل جديد هو أسلوب نضح داخل اللمعة المحلي متطورة. وكلاء المرشح التي تم اختبارها من خلال هذه الطريقة تشمل المخدرات جزيء صغير 13،14، خلوى أو عوامل نمو 15،16، الجين التلاعب وكلاء (استنساخ [كدنا]، سيرنا، الخ) 17-20، والمستحضرات الصيدلانية رواية 21،22.
وحتى الآن، لا يزال الفئران البالون نموذج إصابة واحدة من أكثر النماذج مفيدة لدراسة أمراض الأوعية الدموية / اضطرابات. وهذه هي الخطوة الأساسية من مقاعد البدلاء إلى السرير، وعادة ما الخطوة الأولى تتحرك من في المختبر لفي الجسم الحي، ولكن لا ينبغي أن يكون آخر واحد. نتائج التجارب الفئران تحتاج إلى تداول وزيادة تتميز قبل الترجمة إلى الإنسانالاستخدام السريري، نظرا إلى اختلاف في سرير الأوعية الدموية والأوعية التشريح وكذلك الاختلافات بين الأنواع الجوهرية بين الإنسان والفئران 23-26. ومع ذلك، فإنه لا يزال أداة أساسية في البحوث الطبية متعدية. في حين تستخدم هذه البحوث أن تكون محدودة بسبب عدم وجود الفئران المعدلة وراثيا، أنها لم تعد تكن قضية منذ النهج الجينومية جديدة مثل الزنك والإصبع nucleases 27، TALENs 28 و كريسبر-CAS 29 جعلت الفئران خروج المغلوب يمكن الوصول إليها بسهولة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم إصابة الفئران بالون السباتي وصف جيدا من قبل Tulis في عام 2007 34، وقد سبق بيان شامل وكل تفاصيل هذا الإجراء من قبل الدكتور Tulis. ويوصى بشدة القراء الذين يرغبون في تنفيذ هذا الإجراء لقراءة بروتوكول Tulis ". ومع ذلك، هناك شيء واحد ونحن لا توافق مع الدكتور Tulis: بدلا من تضخيم البال…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. Clowes for first developing and describing this method. We are also thankful to Dr. Tulis for his detailed protocol which has been fundamentally helpful to our previous, current and future work. This work was supported by grants R01HL097111 and R01HL123364 from the NIH to M.T., and by American Heart Association grant 14GRNT18880008 to M.T.
We would like to thank Rachel Newton for her expert technical support and for her valuable help during the filming process.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Fogarty balloon embolectomy catheters, 2 French | Edwards Lifesciences, Germany | 120602F | |
| Deltaphase Operating Board – Includes 2 Pads & 2 Insulators | Braintree Scientific, Inc. | 39OP | |
| LED light source | Fisher Scientific | 12-563-501 | |
| Hartmann Mosquito Forceps 4” curved | Apiary Medical, Inc. San Diego, CA | gS 22.1670 | |
| Crile Retractor 4” double ended | Apiary Medical, Inc. | gS 34.1934 | |
| Other surgical instruments | Roboz Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg, MD | ||
| Peripheral Intravenous (I.V.) Cannula, 24G | BD | 381312 | |
| Ketamine HCl, 100mg/mL, 10mL | Ketaset- Patterson Vet | 07-803-6637 | |
| Xylazine (AnaSed),20mg/mL,20mL | Ketaset- Patterson Vet | 07-808-1947 | |
| Buprenex, 0.3mg/1ml (5 Ampules/Box) | Ketaset- Patterson Vet | 07-850-2280 | |
| Nair Baby Oil Hair Removal Lotion-9 oz | Amazon/Walmart/CVS | N/A | |
| Inflation Device | Demax Medical | DID30 | |
| D300 3-way Stopcock | B.Braun Medical Inc. | 4599543 | |
| Artificial Tears Ointment | Rugby Laboratories, Duluth, GA | N/A |
Referencias
- Landzberg, B. R., Frishman, W. H., Lerrick, K. Pathophysiology and pharmacological approaches for prevention of coronary artery restenosis following coronary artery balloon angioplasty and related procedures. Progress in Cardiovascular Diseases. 39, 361-398 (1997).
- Muller, D. W., Ellis, S. G., Topol, E. J. Experimental models of coronary artery restenosis. J. Am. Coll. Cardiol. 19, 418-432 (1992).
- Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. I. Smooth muscle growth in the absence of endothelium. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 49, 327-333 (1983).
- Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Mechanisms of stenosis after arterial injury. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 49, 208-215 (1983).
- Clowes, A. W., Clowes, M. M. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. IV. Heparin inhibits rat smooth muscle mitogenesis and migration. Circulation Research. 58, 839-845 (1986).
- Li, G., Chen, S. J., Oparil, S., Chen, Y. F., Thompson, J. A. Direct in vivo evidence demonstrating neointimal migration of adventitial fibroblasts after balloon injury of rat carotid arteries. Circulation. 101, 1362-1365 (2000).
- Kiechl, S., Willeit, J. The natural course of atherosclerosis. Part II: vascular remodeling. Bruneck Study Group. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19, 1491-1498 (1999).
- Yamamoto, S., et al. Derivation of rat embryonic stem cells and generation of protease-activated receptor-2 knockout rats. Transgenic Research. 21, 743-755 (2012).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis. Hypertension. 38, 581-587 (2001).
- Meng, H., et al. Complex hemodynamics at the apex of an arterial bifurcation induces vascular remodeling resembling cerebral aneurysm initiation. Stroke. 38, 1924-1931 (2007).
- Sun, C. K., Shao, P. L., Wang, C. J., Yip, H. K. Study of vascular injuries using endothelial denudation model and the therapeutic application of shock wave: a review. American Journal of Rranslational Research. 3, 259-268 (2011).
- Zhang, W., et al. Orai1-mediated I (CRAC) is essential for neointima formation after vascular injury. Circulation Research. 109, 534-542 (2011).
- Ollinger, R., et al. Bilirubin: a natural inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Circulation. 112, 1030-1039 (2005).
- Levitzki, A. PDGF receptor kinase inhibitors for the treatment of restenosis. Cardiovascular Research. 65, 581-586 (2005).
- Asahara, T., et al. Local delivery of vascular endothelial growth factor accelerates reendothelialization and attenuates intimal hyperplasia in balloon-injured rat carotid artery. Circulation. 91, 2793-2801 (1995).
- Lee, K. M., et al. Alpha-lipoic acid inhibits fractalkine expression and prevents neointimal hyperplasia after balloon injury in rat carotid artery. Atherosclerosis. 189, 106-114 (2006).
- Ji, R., et al. MicroRNA expression signature and antisense-mediated depletion reveal an essential role of MicroRNA in vascular neointimal lesion formation. Circulation Research. 100, 1579-1588 (2007).
- Merlet, E., et al. miR-424/322 regulates vascular smooth muscle cell phenotype and neointimal formation in the rat. Cardiovascular Research. 98, 458-468 (2013).
- Huang, J., Niu, X. L., Pippen, A. M., Annex, B. H., Kontos, C. D. Adenovirus-mediated intraarterial delivery of PTEN inhibits neointimal hyperplasia. Arteriosclerosis, Thrombosis, And Vascular Biology. 25, 354-358 (2005).
- Gonzalez-Cobos, J. C., et al. Store-independent Orai1/3 channels activated by intracrine leukotriene C4: role in neointimal hyperplasia. Circulation Research. 112, 1013-1025 (2013).
- Guzman, L. A., et al. Local intraluminal infusion of biodegradable polymeric nanoparticles. A novel approach for prolonged drug delivery after balloon angioplasty. Circulation. 94, 1441-1448 (1996).
- Lipke, E. A., West, J. L. Localized delivery of nitric oxide from hydrogels inhibits neointima formation in a rat carotid balloon injury model. Acta Biomaterialia. 1, 597-606 (2005).
- Osterrieder, W., et al. Role of angiotensin II in injury-induced neointima formation in rats. Hypertension. 18, II60-II64 (1991).
- Powell, J. S., et al. Inhibitors of angiotensin-converting enzyme prevent myointimal proliferation after vascular injury. Science. 245, 186-188 (1989).
- . Does the new angiotensin converting enzyme inhibitor cilazapril prevent restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty? Results of the MERCATOR study: a multicenter, randomized, double-blind placebo-controlled trial. Multicenter European Research Trial with Cilazapril after Angioplasty to Prevent Transluminal Coronary Obstruction and Restenosis (MERCATOR) Study Group. Circulation. 86, 100-110 (1992).
- Faxon, D. P. Effect of high dose angiotensin-converting enzyme inhibition on restenosis: final results of the MARCATOR Study, a multicenter, double-blind, placebo-controlled trial of cilazapril. The Multicenter American Research Trial With Cilazapril After Angioplasty to Prevent Transluminal Coronary Obstruction and Restenosis (MARCATOR) Study Group. J Am Coll Cardiol. 25, 362-369 (1995).
- Geurts, A. M., et al. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433 (2009).
- Tesson, L., et al. Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs. Nature Biotechnology. 29, 695-696 (2011).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31, 681-683 (2013).
- Potier, M., et al. Evidence for STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium influx through ICRAC in vascular smooth muscle cells: role in proliferation and migration. FASEB Journal : Official Publication Of The Federation Of American Societies For Experimental Biology. 23, 2425-2437 (2009).
- Aubart, F. C., et al. RNA interference targeting STIM1 suppresses vascular smooth muscle cell proliferation and neointima formation in the rat. Molecular Therapy. The Journal Of The American Society Of Gene Therapy. 17, 455-462 (2009).
- Berra-Romani, R., Mazzocco-Spezzia, A., Pulina, M. V., Golovina, V. A. Ca2+ handling is altered when arterial myocytes progress from a contractile to a proliferative phenotype in culture. American journal of physiology. Cell Physiology. 295, C779-C790 (2008).
- Bisaillon, J. M., et al. Essential role for STIM1/Orai1-mediated calcium influx in PDGF-induced smooth muscle migration. American journal of physiology. Cell Physiology. 298, C993-C1005 (2010).
- Tulis, D. A. Rat carotid artery balloon injury model. Methods In Molecular Medicine. 139, 1-30 (2007).
- Zhang, W., Trebak, M., Szallasi, A., Bíró, T. Balloon Injury in Rats as a Model for Studying TRP Channel Contribution to Vascular Smooth Muscle Remodeling. T TRP Channels in Drug DiscoveryMethods in Pharmacology and Toxicology. , 101-111 (2012).
- Tulis, D. A. Histological and morphometric analyses for rat carotid balloon injury model). Methods In Molecular Medicine. 139, 31-66 (2007).
