청각 신경의 자극 Optogenetic

Summary

인공 와우 (CI를) 청각 신경에 직접 전기 자극으로 청각 수 있습니다. 그러나 가난한 빈도와 강도 해상도의 CI와 청각의 품질을 제한합니다. 여기에서 우리는 청각 연구와 미래의 CI 개발을위한 대안 전략으로 생쥐에서 청각 신경의 optogenetic 자극을 설명합니다.

Abstract

인공 와우 (CI에)에 의해 나선 신경절 신경 세포 (SGNs) 직접 전기 자극을 이식 청각 장애인 과목 ^1-6 대부분의 오픈 음성 이해를 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 현재의 CI와 사운드 코딩으로 인해 달팽이관 ^7-9의 tonotopic 축을 따라 SGNs의 큰 숫자를 활성화하는 각 전극 접촉에서 폭 넓은 전류 확산 가난한 빈도와 강도의 해상도를 가지고있다. 광 자극은 공간적으로 더 따라서 SGNs의 활성화를 밀폐과 약속 전기 자극, 부호화 높은 주파수 해상도의 대안으로서 제안되었다. 최근, 달팽이관 직접 적외선 조명 청신경 ^(10)에 응답을 연상하는 데 사용되어왔다. 전기 자극 ^{10, 11} 및 불확실성이 기반이되는기구 ^12로 남아보다 그럼에도 불구하고 더 높은 에너지를 필요로한다. 여기에서 우리는 SGNs을 자극하는 optogenetics를 기반으로하는 방법을 설명channelrhodopsin 2 (ChR2) ¹³ ChR2 변종 캐치 ^14의 바이러스 매개 표현의 신경 식으로 형질 전환 마우스를 사용하여 낮은 강도 푸른 빛과 함께. 우리는 작은 인공 개구부 (cochleostomy) 또는 둥근 창을 통해 ChR2 – 표현 SGNs을 자극하는 다이오드 (μLEDs) 및 광섬유 결합 발광 레이저 마이크로 빛을 사용했습니다. 우리는 빛을 유발 전위 (optogenetic 청성 뇌간 반응 : oABR)의 두피 녹음하여 응답을 정량 또는 청각 경로에서 미세 전극 기록에 의해 음향 및 전기 자극으로 그들을 비교했다.

Introduction

세계 보건기구 (WHO)에 따르면, 3억6천만명는 전 세계적으로 청력 상실로 고통. 청각 장애인 대상에서 CI에 의해 SGNs 직접 전기 자극 그들 ^1,2,4,5-의 대부분에서 열려 음성 이해를 할 수 있습니다. 비록 CI에 따라서는 가장 성공적인 neuroprosthesis되고, 20 만 명 이상에 이식되어, 현재 인공 와우 이식에 의해 구동 사운드 인코딩이 제한됩니다. CI에 각 하나가 청각 신경 따라서 달팽이관에 코르티 역기능 감각 기관을 우회 tonotopic 영역을 활성화 전극의 특정 번호에 의해 전기 자극을 기반으로합니다. 정상 청력 청취자 그러나 오늘날의 CI는 최대 12-22 주파수 채널 ^4에 사용, 2,000 개 이상의 주파수를 구별 할 수 있습니다. 이는 많은 다른 소리 주파수 ^{8,15 SGNs을} 나타내는 다수의 활성화 전극 ^7,9 각 자극에서 널리 전류 흐름이다. 이제한 다극 자극을 ​​사용하지만 높은 소비 전력 ^16,17의 비용을 개선 할 수있다. 소리 강도에 대한 그들의 출력 동적 범위는 일반적으로 6-20dB ^4,18 이하로 제한된다. 이러한 이유로, 개선 빈도와 강도 해상도는 시끄러운 환경, 운율 이해와 음악 인식에서 음성 인식을 개선하기 위해 CI 성능을 향상시키기위한 중요한 목표입니다.

청각 신경을 자극하는 다른 옵션은 광 자극이다. 빛은 편리하게, 더 나은 공간 감금을 약속 주파수 해상도를 증가시키고 또한 더 나은 강도 해상도의 결과로, 동적 범위를 확대, 작은 SGN 인구를 대상으로 집중 될 수있다. 실제로, 적외선 빛을 가진 인공 와우 자극은 동물 모델 ^10,11,19 우수한 주파수 해상도를 보여 주었다. 자극이 종류의 한 단점은 전기 자극보다 높은 에너지를 필요로한다는 것이다 <sup> 10, 11. 또한, 직접 청신경을 자극하는 방법의 능력에 대한 우려는 ^{12,20 제기되어왔다.}

적외선 자극에 대한 대안으로, 우리는 SGNs 민감한 빛을 렌더링하는 optogenetics를 사용합니다. Optogenetics 비 침습적으로 유전 및 광학 기술을 결합하고 특히 높은 시간 정밀도 (리뷰 ^{21 – 23)와} 세포를 제어하는 새로운 접근 방법이다. 현재 가장 많이 사용되는 양상은 인 Chlamydomonas reinhardtii에서의 미생물 channelrhodopsin 2 (ChR2) 유전자의 발현을 고용하고 빛 게이트 양이온 채널 ^24을 인코딩, 이들의 변종. ChR2는, 뉴런으로 형질 도입 및 청색 광에 의해 활성화 될 때, 이와 같이 세포를 ^{24 – 27} 탈분극 같은 비 선택적 양이온 채널을 작용 7 – 막 관통 나선 단백질이다. ChR2 잘 특징되었습니다 ^{24,28- 31} 많은 변종이 actio을 수정하기 위해 개발되었습니다n 개의 스펙트럼, 게이트 및 투과성 특성 ^{(32, 33).} 우리 연구의 목적은 청각 경로의 활성화를 위해 인공 optogenetics을 확립하는 것이다. 우리는 청각 신경을 자극하는 optogenetic 접근 방식은 channelrhodopsin의 발현에 나선 신경절의 유전자 조작을가 있어야한다는 사실을 명심해야합니다. 마우스 및 쥐와 함께 작업하는 것은 tonotopic 축을 따라 동물 ^36에서 약간의 변화와 함께 channelrhodopsin의 발현을 제공 사용할 수 형질 전환 동물 ^13,34,35의 사용을 할 수 있습니다. 적절한 Cre 호텔 라인과 조건부 대립 유전자 ^37을 결합하여 세포 고유의 표현을 제공한다. 다른 동물의 나선 신경절에 유전자 전달은 optogenetics ³⁸ 표준 방식 인 아데노 – 연관 바이러스와 같이 우리가 마우스 ^(36)에서 잘 작동하는 것을 보여 주었다 바이러스의 사용을 필요로한다. 유전자 조작과 같은 글로불린 등의 부작용에 ​​대한 외국인 단백질에게 곰 위험을 코딩하는 유전자의 발현북동 응답 및 / 또는 증식, 손상 상태 나 유 전적으로 조작 된 세포의 죽음. 이 데모의 목적을 위해 우리는 광학적으로 청각 경로를 자극하는 네-1 프로모터 ^13에서 나선 신경절 신경 세포에 ChR2을 표현 형질 전환 마우스를 사용합니다. 우리는 우리가 SGNs ^39로 변형 캐치 ^14의 바이러스 매개 전송을 사용하여 설명 된대로 다른 channelrhodopsin 변종이 같은 목적을 위해 이용 될 수 있습니다.

인공 optogenetics는 유전자 조작을 필요로하지만, 최적화 SGN 자극 분자에 대한 튜닝을 제공하고 전기 자극에 비해 약속 주파수 및 세기 해상도를 향상시켰다. 청각 경로의 Optogenetic 자극은 연구 청각에 매우 관련이있다. 예를 들어, 사운드의 스펙트럼 localizat 통합 요구 분석, 개발 중에 tonotopy의 활성에 의존하는 정제의 연구 발전을 약속이온 및 중앙 청각 시스템의 주파수 별 심성 돌기 사이의 상호 작용의 정도.

Protocol

본 연구에 제시된 모든 실험은 실험 동물의 보호 독일어 법에 의해 정의 윤리 기준으로 실시 하였다. 동물 복지에 대한 대학 괴팅겐의 보드 및 니더 작센의 상태의 동물 복지 사무소는 실험을 승인했다. μLED – 자극기의 1 준비 μLEDs를 들어, 첫번째 μLED – 자극기를 준비합니다. 200 μm의 활성 표면에 의해 200 블루 LED를 사용 (μLED, 재료 표 참조). μLED에 솔더 와이?…

Representative Results

최적 cochleostomy은 중요하고 성공적인 실험의 확률을 증가시킨다.이 윈도우가 일정한 작은 것을 의미하고, 내부 인공 구조물의 어떠한 손상도 없다. 예를 들어, 출혈은 강선 vascularis의 손상 될 수 있음을 나타냅니다. 좋은 예는 그림 (b)에 표시됩니다. ChR2 – 형질 전환 마우스를 사용하여, ChR2은 달팽이관 (그림 1C) 내에서 SGNs 표현된다. ,…

Discussion

설명한 실험 SGNs의 optogenetic 자극을 입증하고, 원칙적으로, 또한 내측 및 / 또는 외측 유모 세포를 자극하는 데 사용될 수 opsins의 발현을 제공 하였다. 이 실험은 많은 인내와 배려가 필요합니다. 앞서 언급 한 바와 같이, 가장 중요한 단계는 광원의 좋은 cochleostomy / 라운드 창 삽입뿐만 아니라 적절한 위치 자세이다.

ChR2를 사용 optogenetic 자극과 제한 사항이 있습니다. 자극의 ?…

Materials

Urethane	Sigma Aldrich	U2500-100G	Anesthetic
Xylazine HCl	RXV		Sedative and analgesic
Buprenorphine	Reckitt Benckiser		Analgesic
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue
Dumont #5 – Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20	Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors – Sharp	Fine Science Tools	14060-09	To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs	Fine Science Tools	16004-16	They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473-nm laser	Changchun New Industries	MLL-III473	100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver	Changchun New Industries	DPSSL MLL 100 mW	TTL operated laser driver
250 µm optical fiber	Any comercial ; e.g. Thorlabs	M42L05
Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	PCAOM VIS	Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	160T1-8SAR-24-0.8	Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter	Gentec-EO		Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED	Cree	C470UT200	It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System	Tucker-Davis Technologies	RZ6-A-P1	It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe	Neuronexus	a1x16-5mm-100-177-CM16LP	These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill	World Precision Instruments	503598	Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19007-07
Self tapping bone screw	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19010-10	Reference screw
Micromanipulator	any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis		Positioning of recording probe