Neurale stamceltransplantatie bij Experimentele Contusive Model van Spinal Cord Injury
Summary
Dwarslaesie is een traumatische aandoening die ernstige morbiditeit en hoge sterfte veroorzaakt. In dit werk beschrijven we in detail een kneuzing model van dwarslaesie bij muizen, gevolgd door een transplantatie van neurale stamcellen.
Abstract
Ruggenmergletsel is een verwoestende aandoening klinisch gekenmerkt door een complex van neurologische stoornissen. Diermodellen van ruggenmergletsel kan zowel de biologische reacties op letsel te onderzoeken en mogelijke therapieën te testen. Kneuzing of compressie verwonding geleverd aan het chirurgisch blootgestelde ruggenmerg zijn de meest gebruikte modellen van de pathologie. In dit rapport worden de experimentele kneuzing wordt uitgevoerd met behulp van de oneindige horizon (IH) Impactor apparaat, dat de oprichting van een reproduceerbare letsel diermodel doorlaat definitie van specifieke letsel parameters. Stamceltransplantatie wordt algemeen beschouwd als een potentieel bruikbare strategie voor de genezing van deze invaliderende aandoening. Talrijke studies hebben de effecten van transplanteren verschillende stamcellen geëvalueerd. Hier laten we een aangepaste methode voor ruggenmergletsels gevolgd door staartader injectie van cellen in CD1 muizen. Kortom, bieden wij de procedures voor: i) de cel etikettering wiste een vitale tracer, ii) pre-operatieve zorg van muizen, iii) uitvoering van een contusive dwarslaesie, en iv) intraveneuze toediening van post mortem neurale precursoren. Dit contusie model kan worden gebruikt om de werkzaamheid en veiligheid van stamceltransplantatie in een regeneratieve geneeskunde aanpak te beoordelen.
Introduction
Een dwarslaesie (SCI) is de meest voorkomende letsel veroorzaakt door hoge-energie-trauma zoals motorvoertuigen ongevallen, vallen, sport en geweld 1. In ernstige SCI, de schade kracht vernietigt of schade zenuwweefsel, waardoor plotseling verlies van neurologische functie. Traumatische SCI komt vaak voor bij jonge volwassenen tussen de 10 en 40 jaar oud. Het grote invloed op de patiënt mentale en fysieke conditie en veroorzaakt enorme economische impact op de samenleving 2. De benadering van de behandeling in de acute fase is vaak beperkt tot een hoge dosis corticosteroïden, chirurgische stabilisatie en decompressie om eventueel verzwakken verdere schade 3-4, maar de rollen van deze methoden op het bewegingsapparaat herstel na SCI zijn nog steeds controversieel. Naast acute weefselverlies, de traumatische verwonding en de activatie van secundaire mechanismen van degeneratie veroorzaakt demyelinisatie en dood van meerdere celtypen 5-6. De mate van herstel van de functie kan vantien worden gecorreleerd aan de mate van gespaard witte stof op het letsel plaats 7.
Diermodellen van SCI kan worden gebruikt zowel om de biologische responsen van het weefsel schade onderzoeken en mogelijke therapieën te testen. Bovendien is een nuttig dier model van een menselijk pathologie heeft niet alleen om een aantal aspecten van die voorwaarde te reproduceren, maar moeten ook voordelen ten opzichte van directe klinische observatie en experiment bieden. De meest gebruikte modellen van dwarslaesie betrekken kneuzing of compressie letsel geleverd aan het chirurgisch blootgesteld ruggenmerg 8. De ontwikkeling van een gecontroleerde gewicht neerzetten contusieletsel vertegenwoordigt een belangrijke mijlpaal in de geschiedenis van SCI onderzoek. The Ohio State University ruggenmerg onderzoekscentrum heeft de technologische uitdaging van een inrichting die kan worden gebruikt om een bepaalde samendrukking van het ruggenmerg met parameters van invloed komputergestuurde 9 induceren nagestreefd. Dit werd oorspronkelijk ontworpen voor gebruik with ratten; werd later aangepast toepassen richting muizen 10. De voordelen van een dergelijke benadering zijn dat de biomechanica schade meer kan worden bestudeerd en de parameters van de schade kan een vollediger wijze gedefinieerd om een reproduceerbaar experimenteel model te verkrijgen, waardoor deze nauwkeuriger beoordeling van de effecten van geteste behandelingen op het functioneel herstel proces.
Vele studies hebben de effecten transplantatie van diverse stamcellen in SCI modellen 11 geëvalueerd. We hebben onlangs geïsoleerd volwassen neurale stamcellen uit de Sub-ventriculaire zone (SVZ) enkele uren na de dood van de muis donor 12-13. Deze procedure voorziet in een populatie van neurale stamcellen, de zogenaamde post-mortem neurale precursors (PM-NPC), die lijken voordelig in een regeneratieve geneeskunde aanpak voor het genezen van SCI te zijn. In dit artikel zullen we laten zien: i) het protocol voor mobiele etikettering met de vitale tracer PKH26, ii) de surgsche procedure uit te voeren op traumatische SCI, en iii) de intraveneuze (iv) toediening van gemerkte cellen. Bovendien is in dit werk tonen we aan dat getransplanteerde cellen migreren ruggenmerg laesie plaatsen en differentiëren meestal in microtubule geassocieerd proteïne (MAP) 2 positieve cellen. Bovendien is de differentiatie gepaard met de bevordering van een stabiele herstel van achterste ledematen functie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel beschrijven we een methode om een reproduceerbaar model van traumatisch ruggenmergletsel te verkrijgen met behulp van een oneindige horizon Impactor bij een kracht van 70 Kdyne (ernstige). Met een grotere kracht paradigma (80 Kdyne), kunnen we een ernstiger letsel dat nog wordt geassocieerd met een hogere mortaliteit muizen. Om dit probleem te vermijden, kiezen we gewoonlijk een matige kracht paradigma (70 Kdyne) die is gekoppeld aan een herhaalbare laesie met een geleidelijk herstel van functie en …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Authors acknowledge the economic support by FAIP (Federazione Associazioni Italiane Paraplegici), “Neurogel-en-Marche” Foundation (France), Fondazione “La Colonna”.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PKH26GL-1KT | Sigma | 091M0973 | |
| Infinite horizon (IH) Impactor device | Precision Systems and Instrumentation, LLC | Model 0400 Serial 0171 | |
| Gentamycin 10mg/ml | Euroclone | ECM0011B | 1mg/ml in sterile saline solution |
| Isoflurane-Vet 250ml | Merial | B142J12A | |
| Blefarolin POM OFT 10g | |||
| Slide Warmer | 2Biological Instruments | HB101-sm-402 | |
| Scalpel, size 10 | Lance Paragon | 26920 | |
| Small Graefe Forceps | 2Biological Instruments | 11023-14 | |
| Rongeur | Medicon Instruments | 07 60 07 | |
| Micro scissors | 2Biological Instruments | 15000-00 | |
| Absorbable sutures (4/0) | Safil Quick | C0046203 | |
| Hemostat | 2Biological Instruments | 13014-14 | |
| Reflex 7 wound clip applicator | 2Biological Instruments | 12031-07 | |
| 7mm Reflex wound clips | 2Biological Instruments | 12032-07 | |
| NGS | Euroclone | ECS0200D | |
| Triton X 100 | Merck Millipore | 1086431000 | |
| Anti Microtubule Assocoated Protein (MAP) 2 | Millipore | AB5622 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | |
| FluorSave Reagent | Calbiochem | 345789 | |
| Neural stem cells medium | DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/mL; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/mL; Life Technologies) | ||
| DMEM-F12 | Euroclone | ASM5002 | |
| l-glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| putrescine | Sigma-Aldrich | P5780-25G | |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P6149-1MG | |
| Sodium-selenite | Sigma-Aldrich | S9133-1MG | |
| transferrin | Sigma-Aldrich | T 5391 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
| Heparin sodium-salt | Sigma-Aldrich | H0200000 | |
| bFGF | Life Technology | PHG0024 | |
| h-EGF | Life Technology | PHG6045 | |
| Syringe 0.33cc 29G | Terumo | MYJECTOR | |
| buprenorphine | Schering Plough SpA | TEMGESIC | |
| eye gel | Bausch & Lomb | LIPOSIC |
Referencias
- . Cord Injury Statistical Center: spinal cord injury facts and figures at glance Available from: https://www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202013.pdf (2013)
- Yip, P. K., Malaspina, A. Spinal cord trauma and the molecular point of no return. Molecular Neurodegeneration. 7, 6 (2012).
- Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J Neurotrauma. 28 (8), 1329-1333 (2011).
- Furlan, J. C., Noonan, V., Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Timing of decompressive surgery of spinal cord after traumatic spinal cord injury: an evidence-based examination of pre-clinical and clinical studies. J Neurotrauma. 28 (8), 1371-1399 (2011).
- Sekhon, L. H., Fehlings, M. G. Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury. Spine. 26 (24), 2-12 (2001).
- Gorio, A., et al. Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (14), 9450-9455 (2002).
- Windle, W. F., Clemente, C. D., Chambers, W. W. Inhibition of formation of a glial barrier as a means of permitting a peripheral nerve to grow into the brain. J Comp Neurol. 96 (2), 359-369 (1952).
- Young, W. Spinal cord contusion models. Prog Brain Res. 137, 231-255 (2002).
- Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. An electromechanical spinal injury device with dynamic sensitivity. J Neurotrauma. 9 (3), 187-195 (1992).
- Jakeman, L. B., et al. Traumatic spinal cord injury produced controlled contusion in mouse. J Neurotrauma. 17 (4), 299-319 (2000).
- Sahni, V., Kessler, J. A. Stem cell therapies for spinal cord injury. Nat Rev Neurol. 6, 363-372 (2010).
- Marfia, G., et al. Adult neural precursors isolated from post mortem brain yield mostly neurons: an erythropoietin-dependent process. Neurobiol Dis. 43 (1), 86-98 (2011).
- Gritti, A., et al. Multipotent neural stem cells reside into the rostral extension and olfactory bulb of adult rodents. J Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
- Whetstone, W. D., Hsu, J. Y., Eisenberg, M., Werb, Z., Noble-Haeusslein, L. J. . J Neurosci Res. 74 (2), 227-239 (2003).
- Gonzalez-Lara, L. E., et al. The use of cellular magnetic resonance imaging to track the fate of iron-labeled multipotent stromal cells after direct transplantation in a mouse model of spinal cord injury. Mol Imaging Biol. 13 (4), 702-711 (2010).
- Ottobrini, L., et al. Magnetic resonance imaging of stem cell transplantation in injured mouse spinal cord. Cell R4. 2 (3), e963 (2014).
- Janowwski, M., et al. Neurotransplantation in mice: The concorde-like position ensures minimal cell leakage and widespread distribution of cells transplanted into the cistern magna. Neuroscience Letter. 430 (2), 169-174 (2008).
- Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Hofstetter, C. P., et al. Allodynia limits the usefulness of intraspinal neural stem cell grafts; directed differentiation improves outcome. Nat Neurosci. 8 (3), 346-353 (2005).
- Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14 (9-10), 634-644 (2008).
- Bottai, D., et al. Embryonic stem cells promote motor recovery and affect inflammatorycell infiltration in spinal cord injured mice. Exp Neurol. 223 (2), 452-463 (2010).
