Candida albicans Biofilm sviluppo sulla medicalmente rilevanti Foreign Bodies in un mouse sottocutaneo modello seguito da Bioluminescence Imaging
Summary
We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.
Abstract
Candida albicans sviluppo di biofilm su superfici biotici e / o abiotici rappresenta una minaccia specifica per i pazienti ospedalizzati. Finora, C. biofilm albicans sono stati studiati prevalentemente in vitro, ma vi è la necessità fondamentale per una migliore comprensione di questo processo dinamico in condizioni in vivo. Abbiamo sviluppato un modello di ratto per via sottocutanea in vivo per studiare C. formazione di biofilm albicans. Nel nostro modello, multipla (fino a 9) Candida -infected dispositivi vengono impiantati alla parte posteriore dell'animale. Questo ci dà un grande vantaggio rispetto al sistema venoso centrale modello catetere in quanto ci permette di studiare diversi biofilm indipendenti in un animale. Recentemente, abbiamo adattato questo modello per studiare C. albicans biofilm sviluppo in topi BALB / c. In questo modello, maturo C. biofilm albicans si sviluppano entro 48 ore e dimostrano la tipica architettura biofilm tridimensionale. La quantificazione di biofilm fungineè tradizionalmente analizzato post mortem e richiede sacrificio host. Poiché questo richiede l'uso di molti animali di effettuare studi cinetici, abbiamo applicato non invasivo bioluminescenza (BLI) per longitudinalmente seguire in vivo maturare C. albicans biofilm sviluppare nel nostro modello sottocutaneo. C. cellule albicans erano stati ideati per esprimere il gene Gaussia princeps luciferasi (Gluc) attaccato alla parete cellulare. Il segnale di bioluminescenza è prodotta dalla luciferasi che converte il substrato coelenterazine aggiunto in luce che può essere misurato. Il segnale BLI assomigliava conta di cellule ottenute da cateteri espiantati. Di imaging non invasiva per quantificare de formazione vivo biofilm fornisce applicazioni immediate per lo screening e la validazione di farmaci antifungini in condizioni in vivo, così come per gli studi basati su interazioni ospite-patogeno, dichiara contribuendo ad una migliore comprensionezione della patogenesi delle infezioni da catetere-associate.
Introduction
Candida albicans è un organismo commensale, che può essere trovato in differenti siti di individui sani, per esempio sulla pelle o come parte della flora gastrointestinale e vaginale. Tuttavia, in ospedalizzati, e specialmente immunocompromessi pazienti, può causare una vasta gamma di infezioni 1. In questi individui, il sistema immunitario indebolito permette alle cellule di Candida per diffondere nel flusso sanguigno e di invadere i tessuti più profondi che causano infezioni pericolose per la vita. Inoltre, la presenza di substrati abiotici quali cateteri venosi centrali e delle vie urinarie, valvole cardiache artificiali e fughe può fornire una nicchia per Candida fissaggio 2. Adesione a tali supporti è un prerequisito per l'ulteriore sviluppo del biofilm, che rappresenta uno strato di cellule di lievito e ifali incorporati in materiale polimerico extracellulare, principalmente da polisaccaridi 2. C. catetere -associated infezioni albicanssono associati con alto tasso di mortalità. Una caratteristica generale del biofilm è la loro ridotta sensibilità al antimicotici noti, come azoli 3,4. Solo nuove classi di farmaci antifungini, come echinocandine e la formulazione liposomiale di amfotericina B ha dimostrato di essere attivo contro le infezioni da catetere-associate 5-7. A causa di biofilm resilienza di antimicotici, approcci terapeutici sono molto limitate, spesso conduce a rimozione del catetere e la successiva sostituzione come una soluzione unica.
La maggior parte della nostra attuale comprensione della C. sviluppo biofilm albicans proviene da studi in vitro su substrati abiotici come polistirolo, o plastiche utilizzate per la fabbricazione di dispositivi sopra menzionati, cioè, silicone, poliuretano 2. Questi modelli sono abbastanza avanzato e cercare di simulare la situazione in vivo il più possibile. Tuttavia, questi sistemi non comportano il continuo flusso di sangue e tl sistema immunitario dell'ospite. Questo ha portato allo sviluppo di sistemi modello in vivo, come il modello catetere venoso centrale (CVC) 8-10, il modello stomatite protesi di candidosi orale 11 e un modello murino per catetere associato candiduria 12. Inoltre, C. sviluppo biofilm albicans è stato studiato in vivo sulle superfici mucose, come quelli dalla vagina 13 e 14 della cavità orale. Il nostro laboratorio ha contribuito con la costituzione di un C. sottocutaneo Modello biofilm albicans, che si basa sull'impianto di pezzi catetere infetti sul retro Sprague Dawley 15. Questo modello è stato utilizzato con successo nel nostro laboratorio per testare la suscettibilità biofilm di fluconazolo e echinocandine farmaci 5,16, per studiare l'effetto della terapia combinatoria di diclofenac e caspofungin 17. Più di recente, abbiamo adattato il sistema per l'utilizzo in BALB / c topi 18,19. Inconfronto con altri modelli in vivo, il vantaggio principale di questo modello sottocutanea è la possibilità di studiare più biofilm per animale sviluppato all'interno del lume del catetere pezzi impiantati.
Per ridurre il numero di animali da laboratorio, abbiamo adattato questo modello per studiare lo sviluppo di C. albicans biofilm non invasivo mediante bioluminescenza (BLI) 18,19. Questo metodo ha dimostrato di essere una tecnica potente, che può essere usato per quantificare biofilm misurando il segnale specifico BLI alla regione di interesse (nel nostro caso la zona di cateteri impiantati), evitando il sacrificio di animali. Rispetto ai batteri, che può esprimere sia il gene e il substrato richiesta per la reazione bioluminescenza causa dell'introduzione di una specifica lux operone 20, la maggior parte degli organismi eucarioti, comprese C. albicans, dipendono l'espressione eterologa di un gene luciferasi accoppiato con ilgestione esterna di un substrato specifico, come D-luciferina o coelenterazine 21. Probabilmente a causa della presenza della parete cellulare fungina e C. albicans morfogenesi, la consegna intracellulare del substrato per l'enzima luciferasi era una sfida principale 21. Per risolvere questo problema, Enjalbert et al. 22 progettato un ceppo in cui un C. sintetica albicans versione codone ottimizzata del gene per la naturale secreto Gaussia princeps luciferasi (Gluc) è stata fusa al C. gene albicans PGA59, un GPI- ancorata proteine della parete cellulare. A causa della presenza della luciferasi alla parete cellulare, i problemi relativi alla disponibilità intracellulare del substrato potrebbero essere evitati. Questo particolare sistema è stato utilizzato per studiare infezioni superficiali causate da C. albicans 22. Molto recentemente, BLI è stato utilizzato anche per seguire la progressione della candidosi orofaringea e la sua possible trattamento 23. Questi risultati supportano l'uso di BLI come una tecnica promettente per studiare le infezioni causate da cellule a vita libera, ma anche infezioni periferica associata.
In questo studio, descriviamo la C. albicans sviluppo biofilm su pezzi catetere in poliuretano in topi BALB / c e la sua quantificazione usando BLI. Forniamo un protocollo dettagliato di colonizzazione in vitro dei cateteri in poliuretano, durante il periodo di aderenza seguita da impianto in topi e successivo sviluppo biofilm di animali vivi. Oltre a misurare il segnale emesso dal BLI C. cellule albicans, si determinano anche l'unità formanti colonia per il confronto con la tecnica standard per biofilm fungina carico quantificazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'uso di modelli animali, e in particolare i modelli di roditori, per gli studi dedicati a biofilm microbici è molto importante in quanto il sistema immunitario dell'ospite è un fattore essenziale nella formazione di biofilm che i modelli in vitro non possono spiegare. In questo studio, descriviamo un relativamente semplice sottocutanea C. albicans modello murino biofilm, che può essere facilmente adottata in un laboratorio di ricerca e non richiede forti competenze tecniche. Questo modello …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the KU Leuven PF ‘IMIR’, the FWO Research community on biology and ecology of bacterial and fungal biofilms (FWO: WO.026.11N) and by the FWO project G.0804.11. SK gratefully acknowledges KU Leuven for the PDMK 11/089 fellowship and FWO for the postdoctoral fellowship. We are grateful to Nico Vangoethem for his assistance with preparation of the figures. We would like to acknowledge Celia Lobo Romero for technical assistance during in vivo experimental procedures.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
| Agar granulated | Difco | 214530 | |
| D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
| Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
| RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
| 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
| Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
| Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
| Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
| Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
| Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
| Xylocaine gel (2%) – this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
| Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
| Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
| Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
| 0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
| Equipment | |||
| Cell counting chamber | |||
| Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
| Electric razor | For small animals | ||
| Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
| Heating pad | Leica | 14042321474 | |
| Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
| Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
| BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
| Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |
Referencias
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