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Neurociencias

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

Published: January 10, 2015
doi:
10.3791/52358
, ,
1Institute of Neuroscience and Medicine (INM-2),Research Centre Jülich, 2Department of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical Faculty, JARA,RWTH Aachen University

Summary

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Abstract

Die Kombination von Patch-Clamp-Aufnahmen von zwei (oder mehr) synaptisch verbunden Neuronen (gepaart Aufnahmen) in akuten Hirnschnittpräparate mit gleichzeitiger intrazellulären Biocytin Füllung ermöglicht eine korrelierte Analyse der strukturellen und funktionellen Eigenschaften. Mit diesem Verfahren ist es möglich, durch ihre Morphologie und elektrophysiologische Antwort-Muster zu identifizieren und zu charakterisieren sowohl prä- und postsynaptischen Neuronen. Gepaart Aufnahmen erlauben die Untersuchung der Verbindungsmuster zwischen diesen Neuronen sowie die Eigenschaften von sowohl chemischen und elektrischen synaptischen Übertragung. Hier geben wir eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung der erforderlich ist, um zuverlässige gepaart Aufnahmen zusammen mit einer optimalen Erholung des Neurons Morphologie zu erhalten Verfahren. Wir beschreiben, wie Paare von Neuronen über chemische Synapsen oder Gap Junctions verbunden sind in Hirnschnittpräparate identifiziert. Wir werden darlegen, wie Nervenzellen wieder aufgebaut, um ihre 3D-Morphologie des dendrit erhaltenic und axonalen Domain und wie synaptische Kontakte identifiziert und lokalisiert. Wir diskutieren auch die Vorbehalte und Einschränkungen des gekoppelten Aufnahmetechnik, insbesondere solche mit dendritischen und axonalen Verkürzungen bei der Herstellung von Hirnschnitten verbunden, da diese stark beeinflussen Konnektivität Schätzungen. Jedoch wegen der Vielseitigkeit der gepaarten Aufzeichnungs Ansatz wird ein wertvolles Werkzeug bei der Charakterisierung verschiedener Aspekte der synaptischen Übertragung an identifizierten neuronaler Schaltkreise im Gehirn sein.

Introduction

Neuronaler Schaltkreise zwischen zwei synaptisch gekoppelt Neuronen sind die Bausteine ​​von großer Netzwerke im Gehirn und sind die Grundeinheiten der synaptischen Informationsverarbeitung. Eine Voraussetzung für die Charakterisierung solcher neuronaler Schaltkreise ist, um die Morphologie und funktionellen Eigenschaften sowohl der prä- und postsynaptischen Neuronen Partner, die Art der synaptischen Verbindung (en) und dessen Aufbau und Funktionsmechanismus kennen. In vielen Studien synaptischer Verbindungen zumindest eines der Neuronen in einer Mikroschaltung ist nicht gut charakterisiert. Dies resultiert aus den relativ unspezifisch Stimulationsprotokolle oft in Studien synaptischer Verbindungen verwendet. Deshalb werden die strukturellen und funktionellen Eigenschaften von präsynaptischen Neuron sind entweder gar nicht oder nur in einem ziemlich kleinen Ausmaß identifiziert (dh die Expression von Markerproteine ​​etc.). Gepaart Aufnahmen in Kombination mit intrazelluläre Färbung von Markern such als Biocytin, Neurobiotin oder Fluoreszenzfarbstoffe sind für die Untersuchung kleiner neuronaler Schaltkreise besser geeignet. Diese Technik erlaubt es vielen strukturellen und funktionellen Parameter eines morphologisch identifizierten synaptische Verbindung gleichzeitig zu untersuchen.

So genannte "einheitliche" monosynaptische Verbindungen zwischen zwei Neuronen in beiden kortikalen und subkortikalen Hirnregionen 1-10 mit akuten Schnittpräparate untersucht. Zunächst wurden scharfe Mikroelektroden in diesen Experimenten verwendet; später wurde Patch-Clamp-Aufzeichnung, um Aufnahmen von synaptischer Signale mit einem niedrigeren Geräuschpegel und einer verbesserten zeitlichen Auflösung zu erhalten beschäftigt.

Ein bedeutender technischer Fortschritt war die Verwendung von Infrarot-Differential-Interferenz-Kontrast (IR-DIC) -Optik 11-14, eine mikroskopische Technik, deutlich verbessert die Sichtbarkeit und die Identifizierung von Neuronen im Gehirn Scheibe, so daß es möglich wurde to erhalten Aufnahmen visuell identifiziert synaptischen Verbindungen 15-17. In der Regel werden gepaart Aufnahmen bei akuten Scheibe Vorbereitungen abgeschlossen; nur wenige Publikationen sind Berichterstattung Aufnahmen von synaptisch verbundenen Neuronen in vivo 18-20.

Der wichtigste Vorteil der gekoppelten Aufnahmen ist die Tatsache, dass eine funktionelle Charakterisierung kann mit einer morphologischen Analyse sowohl der Licht- und elektronenmikroskopischen Ebene kombiniert werden (siehe z. B., 7,16,21). Nach histochemische Verarbeitung wird das dendritische und axonale Morphologie des synaptisch verbundenen Neuronenpaar zurückzuführen. Anschließend ist es möglich, morphologische Merkmale, wie Länge, Raumdichte, Orientierung, Verzweigung usw. quantifizieren Diese Parameter können dann die Grundlage für eine objektive Klassifizierung eines bestimmten synaptischen Verbindung. Weiters ist im Gegensatz zu den meisten anderen Techniken zur Untersuchung neuronaler connecti verwendetvität, gepaart Aufnahmen ermöglichen auch die Identifizierung der synaptischen Kontakte für einheitliche synaptischen Verbindungen. Diese kann direkt unter Verwendung einer Kombination von Licht- und Elektronenmikroskopie 16,21-27 oder mit Kalzium-Imaging 28,29 von dendritischen Dornen erfolgen. Jedoch mit dem letzteren Ansatz nur exzitatorischen aber nicht hemmenden Verbindungen untersucht werden, wie es benötigt Calciumeinstrom über die postsynaptische Rezeptorkanäle.

Zusätzlich zu einer genauen Analyse der synaptischen Übertragung in einem definierten neuronalen Mikro gepaart Aufnahmen auch die Untersuchung der synaptischen Plastizität Regeln 30,31 erlauben oder – in Kombination mit Agonist / Antagonist-Anwendung – die Modulation der synaptischen Übertragung von Neurotransmittern wie Acetylcholin 32 und Adenosin 33.

Protocol

Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der EU-Richtlinie über den Schutz der Tiere, des Deutschen Tierschutzgesetz (Tierschutzgesetz) und den Richtlinien des Bundesverbandes der europäischen Versuchstierkunde durchgeführt. 1. Set-up für die Elektrophysiologie Vor Beginn gepaart Aufnahme muss ein Elektro Set-up gebaut werden. Eine kurze Zusammenfassung, wie eine solche Einrichtung zusammengesetzt ist wie folgt: Installieren ei…

Representative Results

Gepaart Aufnahmen sind das Mittel der Wahl für eine eingehende Charakterisierung von morphologisch identifiziert uni- oder bidirektional synaptischen Verbindungen sowie Gap Junction (elektrische) Anschlüsse (Abbildung 1). Ein Beispiel für ein gekoppeltes Aufzeichnungsschicht 4 in der somatosensorischen Kortex Lauf ist in 1A gezeigt. Sowohl unidirektionale exzitatorische und inhibitorische synaptische Verbindungen (1B, C) ​​charakterisiert werden. Weiterhin gepaar…

Discussion

Gekoppelte Aufnahmen von synaptisch gekoppelt erregenden und / oder hemmenden Neuronen eine sehr vielseitige Vorgehensweise für die Untersuchung neuronaler Schaltkreise. Nicht nur, dass diese Vorgehensweise erlauben es, synaptische Verbindungen zwischen Neuronen-Typen schätzen, sondern ermöglicht auch die Bestimmung der funktionellen Eigenschaften der Verbindung und der Morphologie der prä- und postsynaptischen Neuronen. Außerdem Agonisten und / oder Antagonisten kann leicht an Neuronen im Schnittpräparate angewen…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank all members of ‘Function of Neuronal Microcircuits’ Group at Institute of Neuroscience and Medicine, INM-2, Research Centre Jülich and the ‘Function of Cortical Microcircuits’ Group in the Dept. of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical School, JARA, RWTH Aachen University for fruitful discussions. This work was supported by the DFG research group on Barrel Cortex Function (BaCoFun).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier HEKA EPC 10 USB Triple with 2-3 preamplifiers
Microscope Olympus BX51WI with 2 camera ports and a 4× objective, a 40× water-immersion objective
Camera TILL Photonics VX55 infrared CCD camera
Workstation Luigs & Neumann Infrapatch 240 with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope
Micromanipulator Luigs & Neumann SM-5 x-y-z manipulators for 2-3 preamplifiers
Faraday cage Luigs & Neumann
Anti-vibration table Newport Spectra-Physics
Patchmaster HEKA
Microtome Microm International HM650V
Micropipette puller HEKA Sutter P-97
Neurolucida system Microbrightfield with Neurolucida and Neuroexplorer softwares
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Keywords: Paired Patch-clamp RecordingAcute Brain SliceNeuronal MicrocircuitsSynaptic TransmissionElectrophysiologyMorphologyConnectivityChemical SynapsesGap JunctionsNeuron ReconstructionDendritic TruncationAxonal Truncation
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Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358, doi:10.3791/52358 (2015).
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