Generatie van muizen pacemaker celaggregaten Gebaseerd op ES-Cell-programmering in combinatie met Myh6-Promoter-Selection
Summary
Dit protocol beschrijft hoe functionele sinus nodale weefsel van muizen pluripotente stamcellen (PSC) te produceren. T-Box3 (TBX3) overexpressie plus hartmyosine-zware-keten (Myh6) promotor antibiotische selectie leidt tot zeer zuivere cel pacemaker aggregaten. Deze "Induced-sinoatriale-lichamen" ("iSABs") bevatten meer dan 80% pacemaker cellen, vertonen een zeer verhoogde kloppend tarieven en zijn in staat om myocard ex vivo tempo.
Abstract
Behandeling van het "sick sinus syndrome" is gebaseerd op kunstmatige pacemakers. Deze van gevaren zoals batterij falen en infecties. Bovendien missen ze hormoon respons en de algemene procedure kostenintensief. "Biologische pacemakers" gegenereerd op basis van PSC's kan een alternatief zijn geworden, maar de typische inhoud van de pacemaker cellen in embryoiden Bodies (EBS) is extreem laag. De beschreven protocol combineert "forward programmering" van muizen PSC via de sinusknoop inductor TBX3 met Myh6-promotor gebaseerd antibiotische selectie. Dit levert cardiomyocyten aggregaten constante van> 80% fysiologisch functionele pacemaker cellen. Deze "geïnduceerde-sinoatriale-lichamen" ("iSABs") worden spontaan samentrekkende op nog onbereikte frequenties (400-500 bpm) overeenkomt met nodale cellen geïsoleerd van de muis harten en zijn in staat om muizen myocard ex vivo tempo. De beschreven protocol zeer zuivere sinusnodale enkele cellen worden gegenereerd die bijvoorbeeld kunnen worden gebruikt voor in vitro drug testen. Bovendien kan de gegenereerde volgens dit protocol iSABs essentieel om de kern tissue engineering worden.
Introduction
De term "sick sinus syndroom" vat meerdere ziektes die de verslechtering van de cardiale pacemaker systeem. Het bestaat uit pathologische, symptomatische sinusbradycardie, sinoatriale blok, sinusstilstand evenals de tachycardie-bradycardie syndroom. Daarbij wordt een "sick sinus syndrome" vaak gepaard met algemene hartziekten, zoals een ischemische hartziekte, cardiomyopathie of myocarditis. Momenteel zijn therapeutische benaderingen gebaseerd op de implantatie van elektrische pacemakers. Echter, dit gaat gepaard met een aantal risico's zoals infecties en batterij defect. Kortom, de incidentie van complicaties is nog steeds zeer hoog bij patiënten met een pacemaker geïmplanteerd. Bovendien, in tegenstelling tot het endogene pacemaker, deze apparaten niet reageren op hormonale stimulatie.
Een toekomstig alternatief kan rekenen op de beschikbaarheid van "biologische pacemakers" waarvoor PSC's zou kunnen dienenals geschikte cellulaire bron en die zou ook zeer waardevol in vitro drug testen. Toch een groot probleem ligt in de zeer zeldzame verschijning van sinus nodale cellen binnen embryoid instanties (EBS) – dit meestal niet meer dan ~ 0,5% 1.
Eerder werd aangetoond dat "forward programmering" van specifieke subtypen cardiomyocyten haalbaar door overexpressie van verschillende vroege cardiovasculaire transcriptiefactoren zoals Mesoderm-specifieke posterior 1 (MesP1) en NK2 transcriptiefactor verband, locus 5 (Nkx2.5) 2, 3. Voor normale grootte en functie van de sinusknoop (SAN), het T-box transcriptiefactor Tbx3 cruciaal, waarvan is aangetoond dat de pacemaker genprogramma initiëren en differentiatie regelen van de SAN 4. Hoewel deze verbeterde de verschijning van functionele pacemaker cellen, de inhoud nog niet in het gehele cardiomyocytic celpopulatie bedraagt dan ~ 40%.
Daarom is een extra Myh6-promotor gebaseerd antibiotische selectie stap 5 werd geïntroduceerd door ons. Dit leidt uiteindelijk tot nog onopgemerkt cardiomyocyten aggregaten ("geïnduceerde sino-atriale organen;" iSABs "), die sterk verhoogde slaan frequentie (> 400 bpm) in vitro vertonen, voor het eerst benadert die van een muis hart en vergelijkbare in vitro gekweekt sinus nodale cellen geïsoleerd uit een muizen hart 6. Onder Isoprenaline administratie zelfs kloppend frequenties van 550 bpm worden bereikt. Met name iSABs omvatten meer dan 80% functionele knooppunten cellen zoals blijkt uit uitgebreide fysiologische analyses 7. Onlangs heeft een aantal benaderingen van sinus genereren nodale cellen met behulp van directe herprogrammering 19, oppervlakte markers 14 of farmacologische behandeling met kleine moleculen 16,17 werden beschreven. Maar geen van deze methoden tot een dergelijk hoge zuiverheid pacemakercellen en slaan frequenties dicht bij de murine hijkunst als waargenomen in iSABs.
Bovendien, in een ex vivo model van gecultiveerde volwassen muis ventriculaire schijfjes die hun spontane kloppend activiteit hebben verloren, de iSABs zijn in staat om te integreren in de slice weefsel, waardoor spontaan actief blijven en robuust pacing het hart plakjes om contracties 7. Een gedetailleerd protocol voor het genereren van deze iSABs wordt beschreven in dit document.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het vermogen om te produceren stamcellen afgeleide pacemaker cellen reconstitutie van de juiste hartritme mogelijk in de betekenis van "biologische pacemakers". Evenzo zal drugstests in vitro profiteren van hun beschikbaarheid. PSC's kan aanleiding geven tot celtype van het lichaam van een zoogdier waaronder hartspiercellen met mobiele pacemaker eigenschappen 8,9,10,11,12,13 geven. Echter, meestal de celpopulaties binnen "embryoiden Bodies" zeer heterogeen, hetgeen onvermijdelijk leidt…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number |
| Iscove's liquid medium with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0465 |
| DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0435 |
| CLS type IV, CLS IV | Biochrom AG | C4-22 |
| Non-essential amino acids | Biochrom AG | K 0293 |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Biochrom AG | L 0473 |
| G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile | Biochrom AG | A 2912 |
| Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile | Brand | 703409 |
| Accutase | eBioscience,Inc. | 00-4555-56 |
| Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette | Eppendorf | 4861000155 |
| Falcon Cell Strainer 40µm | Falcon | 352340 |
| Penicillin/Streptomycin | GE Healthcare | P11-010 |
| Petri Dishes | Greiner BioOne | 663102 |
| DPBS without Ca and Mg | PAN-Biotech | P04-36500 |
| Fetal bovine serum | PAN-Biotech | P30-3302 |
| Leukemia inhibitory factor | Phoenix Europe GmbH | LIF-250 |
| Quadratic petri dishes | Roth | PX67.1 |
| Gelatin from cold water fish skin | SigmaAldrich | G7765 |
| 2-Mercaptoethanol | SigmaAldrich | M3148 |
| 1-Thioglycerol | SigmaAldrich | M6145 |
| Tissue culture dishes | TPP | 93100 |
| Tissue culture flask | TPP | 90076 |
| Tissue culture test plates (24 well) | TPP | 92424 |
Referencias
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48 (3), 173-182 (1991).
- David, R., et al. MesP1 drives vertebrate cardiovascular differentiation through Dkk-1-mediated blockade of Wnt-signalling. Nat Cell Biol. 10, 338-345 (2008).
- David, R., et al. Forward programming of pluripotent stem cells towards distinct cardiovascular cell types. Cardiovasc Res. 84 (2), 263-272 (2009).
- Hoogaars, W. M., et al. Tbx3 controls the sinoatrial node gene program and imposes pacemaker function on the atria. Genes Dev. 21 (9), 1098-1112 (2007).
- Klug, M. G., Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., Field, L. J. Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts. J Clin Invest. 98 (1), 216-224 (1996).
- Marger, L., et al. Pacemaker activity and ionic currents in mouse atrioventricular node cells. Channels (Austin). 5 (3), 241-250 (2011).
- Jung, J. J., et al. Programming and isolation of highly pure physiologically and pharmacologically functional sinus-nodal bodies from pluripotent stem cells). Stem cell reports. 2 (5), 592-605 (2014).
- Maltsev, V. A., Wobus, A. M., Rohwedel, J., Bader, M., Hescheler, J. Cardiomyocytes differentiated in vitro from embryonic stem cells developmentally express cardiac-specific genes and ionic currents. Circulation research. 75 (2), 233-244 (1994).
- He, J. Q., Ma, Y., Lee, Y., Thomson, J. A., Kamp, T. J. Human embryonic stem cells develop into multiple types of cardiac myocytes: action potential characterization. Circ Res. 93 (1), 32-39 (2003).
- Yanagi, K., et al. Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels and T-type calcium channels confer automaticity of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem cells. 25 (11), 2712-2719 (2007).
- Barbuti, A., et al. Molecular composition and functional properties of f-channels in murine embryonic stem cell-derived pacemaker cells. J Mol Cell Cardiol. 46 (3), 343-351 (2009).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American journal of physiology. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
- David, R., Franz, W. M. From pluripotency to distinct cardiomyocyte subtypes. Physiology (Bethesda). 27 (3), 119-129 (2012).
- Scavone, A., et al. Embryonic stem cell-derived CD166+ precursors develop into fully functional sinoatrial-like cells). Circ Res. 113 (4), 389-398 (2013).
- Morikawa, K., et al. Identification, isolation and characterization of HCN4-positive pacemaking cells derived from murine embryonic stem cells during cardiac differentiation. Pacing Clin Electrophysiol. 33 (33), 290-303 (2010).
- Wiese, C., et al. Formation of the sinus node head and differentiation of sinus node myocardium are independently regulated by Tbx18 and Tbx3. Circ Res. 104 (3), 388-397 (2009).
- Kleger, A., et al. Modulation of calcium-activated potassium channels induces cardiogenesis of pluripotent stem cells and enrichment of pacemaker-like cells. Circulation. 122 (18), 1823-1836 (2010).
- Bakker, M. L., et al. T-box transcription factor TBX3 reprogrammes mature cardiac myocytes into pacemaker-like cells. Cardiovasc Res. 94 (3), 439-449 (2012).
- Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nat Biotechnol. 31 (1), 54-62 (2013).
- Johns, D. C., et al. Adenovirus-mediated expression of a voltage-gated potassium channel in vitro (rat cardiac myocytes) and in vivo (rat liver). A novel strategy for modifying excitability. J Clin Invest. 96 (2), 1152-1158 (1995).
- Nuss, H. B., Marban, E., Johns, D. C. Overexpression of a human potassium channel suppresses cardiac hyperexcitability in rabbit ventricular myocytes. J Clin Invest. 103 (6), 889-896 (1999).
