Un protocole pour Lentiviral transduction et analyse aval de intestinale organoïdes

Summary

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Abstract

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

Introduction

L'épithélium intestinal est l'un des tissus les plus proliférant rapidement corporels, qui a causé d'attirer un grand intérêt de la recherche sur les cellules cancéreuses et souches. En 2009, une technique a été publié pour générer cultures durables de petites cryptes intestinales dans matrigel, conserver une structure en 3 dimensions ^1. Ces structures, appelées organites intestinaux, peuvent être cultivées en utilisant des techniques standard, avec entourant milieu supplémenté avec un certain nombre de facteurs de croissance définis, y compris la BMP-signalisation inhibiteur de la voie noggine (cheville en bois), la voie Wnt-signalisation activateur rspondin 1 (Rspo1) et le facteur de croissance épidermique (EGF) tout trouvé pour améliorer la prolifération intestinal ^2-4.

Organites dépassent lignées cellulaires de cancer dans les aspects traditionnels qu'ils sont non mutée, ont maintenu hiérarchie de cellules souches, afficher polarisation cellulaire intacte et la différenciation d'exposition dans toutes les lignées cellulaires trouvés dans la petite int naissantépithélium Estinal. Comme ils peuvent être transduites pour mener transgènes ou interférence ARN constructions ^5, ils sont utilisés pour étudier des éléments génétiques spécifiques, l'emportant sur ​​des expériences utilisant des souris transgéniques en facettes de coût et de vitesse. L'expression transgénique dans organites peut être effectuée en utilisant soit retroviral murin ou vecteurs lentiviraux ^6,7. En raison des limitations de retrovirus murins, capables de transduire des cellules mitotiques exclusivement ^8, la transduction lentivirale est plus fréquemment utilisé pour des cellules qui sont difficiles à infecter, tels que les organites.

Virally transduction et exprimant de façon stable organoïdes transgéniques peuvent être utilisés pour une multitude d'analyses en aval, y compris ARN analyses quantitatives et immunohistochimie. Pris ensemble, la culture de organites de cellules épithéliales intestinales primaires a évolué pour devenir une technique de routine qui est facile à mettre en œuvre sans exigences spécifiques de laboratoire, et est devenu le roman standard CEll culture dans la recherche sur l'épithélium intestinal.

Techniques de transduction virale et l'analyse aval ultérieure dans organites sont fastidieux d'effectuer des expériences et d'aider organoïdes nous avons généré ce protocole vidéo, montrant des méthodes pour lentiviral transduction des organites culture. Nous montrons en outre la façon dont le traitement correct des organites peuvent augmenter le rendement et donc d'améliorer les performances de l'analyse en aval en utilisant des techniques d'ARN ou immunohistochimie. Dans le protocole, organites qui sont dérivés de petites cryptes intestinales ont été exclusivement utilisées, bien que les techniques décrites peuvent être appliquées aux organites côlon ainsi.

Protocol

1. Préparation de Polyéthylènimine (PEI) comme réactif de transfection Dissoudre environ 150 mg de PEI dans 100 ml d'H 2 O. Réglez solution à pH 7,4 par addition de HCl jusqu'au solution devient limpide et remuer jusqu'à dissolution complète. Cela peut prendre entre 10 et 60 min et ajouter de l'eau à une concentration de 1 mg / ml final. Lorsque claire, filtrer la solution à travers le filtre PEI 0,22 um stérile et stocker dans un congélateur à -80 ?…

Representative Results

Transduction lentiviral Organoid La technique de transduction organoïde utilisant des particules lentiviraux dépend de manipulation correcte des organites avant et pendant la transduction. Organites (figure 3A) ont été cultivées et ils ont été perturbés dans cryptes simples (figure 3B). Comme indiqué précédemment, ces cryptes simples, lorsqu'elles sont cultivées en présence de l'inhibiteur de GSK3 Chir99021 cryptes sont devenues…

Discussion

Le protocole vidéo actuel décrit transduction lentiviral des organites de l'épithélium intestinal primaire et l'analyse en aval de ces organites en utilisant des techniques d'ARN quantitatifs et immunohistochimie.

Transduction lentivirale est souvent réalisée dans des cellules adhérentes ou flottantes dans des plaques de culture. Étant donné que la structure tridimensionnelle des organites les rend difficiles à pénétrer par des particules virales, un certain nombre de…

Materials

Reagent	Company	Cat. No.
Polyethylene imine	polysciences	23966-2
DMEM medium	Lonza	BE12-614F
Fetal calf serum	Lonza	DE14-801F
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Glutamin	Invitrogen	25030-024
matrigel	BD	BD 356231
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-acetyl cysteine	Sigma	A9165-1G
mouse Egf	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1M	Invitrogen	15630-056
glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
polybrene	Sigma	107689
nicotinamide	Sigma	N0636
Trypsin	Lonza	BE02-007E
puromycin	sigma	P 7255
Rneasy mini kit	Qiagen	74106
b-mercaptoethanol	Merck	8,057,400,250
Ovation Pico WTA system	NuGen	3300-12
paraformaldehyde	Sigma	252549-1L
glass vial conical 12mm x 75mm 5ml	VWR	LSUKM12
Eosin Yellowish	VWR	1,159,350,025