Дизайн, обработка поверхности, сотовая Покрытие и культивированию модульных нейронных сетей, состоящих из Функционально взаимосвязанных схем
Summary
Эта рукопись описывает протокол расти в пробирке модульных сетей, состоящих из пространственно ограниченных, функционально взаимосвязанных нейронов схем. Полимерный маска используется для шаблона белка слой, чтобы способствовать клеточной адгезии по сравнению с культивирования подложки. Плиты нейроны растут на покрытых областях, устанавливающих спонтанные связи и проявляющих электрофизиологические деятельности.
Abstract
Мозг работает посредством координации активации и динамической связи нейронов собраний. Основным открытым вопрос о том, как Обширный репертуар динамических мотивов, которые лежат в основе самых разнообразных функций мозга, может возникнуть из фиксированного топологического и модульной организации цепей мозга. По сравнению с исследованиями в естественных условиях нейронных цепей, которые представляют внутренние экспериментальные трудности, препараты в пробирке предложить гораздо больший возможность манипулировать и щуп структурные, динамические и химические свойства экспериментальных нейронных систем. Эта работа описывает экспериментальную методику в пробирке, которая позволяет выращивать модульных сетей, состоящих пространственно отдельных, функционально взаимосвязанных нейронов собраний. Протокол позволяет контролировать двумерный (2D) Архитектура нейронной сети на разных уровнях топологической сложности.
Нужную сеть рисунка может бытьдостигается как на обычных листках покрытия и подложки встроенный микро электродных массивов. Микромеханический структуры тиснением на кремниевой пластине и используются для создания биосовместимых полимерных трафареты, которые включают в себя отрицательные черты желаемого сетевой архитектуры. В трафареты размещены на подложках культивирования в течение процедуры покрытия поверхности с молекулярной слоя для содействия клеточную адгезию. После удаления трафаретов, нейроны высевают и они самопроизвольно перенаправлен в районы с покрытием. При уменьшении между отсека расстояние, можно получить либо отдельные или соединенные между собой нейронов схем. Способствовать выживанию клеток, клетки культивируют совместно с поддерживающей нейронной сети, который расположен на периферии чашки для культивирования. Электрофизиологические и оптические записи активности модульных сетей, полученных соответственно с помощью подложки встроенный микро электрода массивов и визуализации кальция представлены. Хотя каждый модуль показывает SPONTпрочие обязательства глобальные синхронизация, появление синхронизации межмодульной регулируется по плотности связи между цепями.
Introduction
Экспериментальные и теоретические доказательства подтверждают возможность, что мозг работает на основе скоординированных активации клеточных ансамблей 1-5, которые можно рассматривать как динамические функциональных блоков, которые временно взаимодействуют друг с другом, формирования и основных разных состояний мозга. Функциональный модульность также зависит от и связанные со структурной модульной организации цепей мозга 6,7. Как функция и структура цепей мозга взаимно формировать друг друга прежнему является одним из основных нерешенных вопросов в области неврологии. Чтобы обеспечить более глубокое понимание этого вопроса, важно определить оптимальные экспериментальные основы, где можно обратиться, по крайней мере, частично, эти вопросы. С контролем манипуляции с пространственно-временной динамики нейронных сетей в экспериментах in vivo с является сложной задачей, разработка моделей в пробирке нейронных сетей представляет значительный интерес в связи с их легкой соотвessibility, мониторинг, манипулирование и моделирования 8,9. В последние годы, в пробирке технологий, поддерживаемых передовых методов субстрат паттерна позволили вызвать нейронных сетей для разработки ряда предопределенных модульных конструкций 3 и изучать функциональные свойства сетей с введенных топологий 10. В частности, методы были недавно использованы для организации сетей путем введения физические ограничения 4,11. В самом деле, изучить связь между структурой и функцией в нейронных сетях и обеспечить упрощенное, но правдоподобное представление взаимодействия нейронов сборки системы, в пробирке должна обеспечивать взаимосвязанных нейронов субпопуляции. Широко изучается 2D однородные нейронные культуры не накладывает каких-либо пространственных ограничений на самоорганизации выходящего проводов цепей. Поэтому возможный подход к формированию узлов искусственно соединенных между собой клеток является положение различных популяции нейронов в ссоруially различных областях. Расстояние между этих областях не мешает Интер сборок соединения. Этот подход, в то время обеспечивая значительный контроль над сложность сети, как было показано, обеспечивает богатый репертуар моделей синхронизации 6,7,12.
Для того, чтобы облегчить воспроизводимый культивирование модульных нейронных узлов, протокол, чтобы собрать самоорганизацию сетей в нейронных кластеров, связанных аксонов и дендритов представлены и описаны. Полимерной структуры для физического удержания нейрональных культур был создан из polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS является эластомер широко используется для биомедицинских применений благодаря своей биосовместимости, прозрачности и проницаемости для газов 13. PDMS подготовлен и исключены из микромеханического SU8 2075 14,15 структуры спин-покрытия жидкие PDMS на "хозяина", как описано ранее в Джекман и др. 16 TОн достиг рисунком нейронных сетей состоят из взаимосвязанных модулей разного размера, и они были успешно получены на обоих стеклах и микро матриц электродов (МПС) 17-20. Плотность соединений между модулями может изменить характеристики сетевой синхронизации, от полностью синхронизированной сети, характерной для однородных культур, в переходных режимах синхронизации между модулями.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол расти 2D модульные нейронных сетей в пробирке, состоящей из функционально взаимосвязанных контуров описывается. Процедура основана на сотовой рисунка клеевой слой. Нанесение рисунка достигается с PDMS трафареты воспроизведения отрицательный признак нужного сетевой архи?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Европейским проекта BRIANBOW (FP7- молодых исследователей, авторы хотели бы поблагодарить д-ра Якопо Tessadori за полезные замечания по рукописи, и Сильвия Chiappalone за ее помощь в написании графики, используемые в видео.
Materials
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene Vacuum Chamber | Thermo | 5305-0609 | |
| Poly-D-Lysine PDL | Sigma | P7886 | |
| silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Spin Coater | Laurell – Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| 12 well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
| silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: www.microchem.com |
Referencias
- Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
- Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).
- Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons. European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).
- Berdondini, L., et al. A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons. Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PloS One. 9, e107400 (2014).
- Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits. PloS One. 5, e14443 (2010).
- Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology. Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).
- Bonifazi, P., et al. In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses. Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).
- Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording. Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).
- Marconi, E., et al. Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology. PloS One. 7, e34648 (2012).
- Taylor, A. M., Jeon, N. L. Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).
- Sorkin, R., et al. Compact self-wiring in cultured neural networks. J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems. Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).
- Campo, A. G. C. SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography. Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).
- Liu, G. T. Y. Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist. Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).
- Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).
- Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro. Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).
- Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture. Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).
- Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).
- Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings. J Neural Eng. 8, 056008 (2011).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab Chip. 9, 404-410 (2009).
- Georger, J. H., et al. Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth. Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).
- Torimitsu, K., Kawana, A. Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture. Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).
- Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks. Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).
- Petrelli, A., et al. Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays. Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).
- Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Hippocampal networks on reliable patterned substrates. Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).
