LEPR<sup> Db</sup> Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact
Summary
We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.
Abstract
Il diabete di tipo 2 è una malattia cronica che colpisce 382 milioni di persone nel 2013, e si prevede un aumento di 592 milioni entro il 2035 1. Nel corso degli ultimi 2 decenni, il ruolo di una disfunzione delle cellule beta nel diabete di tipo 2 è stato chiaramente stabilito 2. Progresso della ricerca ha richiesto metodi per l'isolamento di isole pancreatiche. Il protocollo di isolamento delle isole qui presentata condivide molte fasi comuni con protocolli di altri gruppi, con alcune modifiche per migliorare la resa e la qualità delle isole isolate sia dal tipo selvatico e diabetico db LEPR (db / db) topi. Un live-cell imaging metodo 2-fotone è quindi presentata che può essere utilizzato per studiare il controllo della secrezione insulinica entro isolotti.
Introduction
Il ruolo della disfunzione delle cellule beta nella malattia è stato ampiamente riconosciuto 3,4. Le linee cellulari, come il MIN6 e INS-1 sono strumenti utili per comprendere la biologia del comportamento delle cellule beta. Tuttavia, il controllo fisiologico della secrezione di insulina avviene all'interno delle isole di Langerhans. Questi isolotti contengono migliaia di cellule beta fitte, così come i vasi sanguigni e di altri tipi di cellule endocrine. Questo ambiente all'interno dell'isolotto influenza la secrezione di insulina, ed è probabile che sia importante nel diabete. Pertanto, per comprendere il controllo fisiologico della secrezione di insulina, e la fisiopatologia della malattia, è essenziale studiare isolotti intatti.
Isolamento Islet
Isole umane vive e, in particolare, isolotti umani provenienti da pazienti affetti da diabete di tipo 2 sono difficili da ottenere. Inoltre, isole umane hanno limitate possibilità di manipolazione molecolare sperimentale. I ricercatori hanno quindi impiegato èlascia da animali e modelli animali di diabete di tipo 2. Un tale modello di malattia è il mouse db / db. Si tratta di una mutazione spontanea che i modelli di diabete di tipo 2 con una progressione fenotipo che ricorda molto da vicino la malattia umana 5,6. Il protocollo presentato qui per l'isolamento delle isole da diabetici db / db topo ha molti punti in comune con gli altri gruppi con alcuni filtri per migliorare la resa, la purificazione e la sopravvivenza delle isole migliorata.
Imaging 2 fotone
Il live-cella 2 fotoni test qui descritta permette ai ricercatori di quantificare il numero e valutare le caratteristiche dei singoli granuli insulina contenente da molte cellule del diabetico 7 e wild type isolotti 8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il fattore più critico nell'isolamento isolotto è la perfusione iniziale del pancreas; un sotto perfuso pancreas risultati in una resa isolotto notevolmente inferiore. Altri fattori influenzano anche la qualità di isolamento, come il tempo di digestione e il livello di agitazione che potrebbe in parte compensare il livello di perfusione. Ad esempio, un pancreas pienamente perfuso dovrà essere incubate a 37 ° C per ~ 18 min 30 sec agitatore, al contrario un sotto digerito pancreas possono richiedere ~ 20 min dig…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Liberase TL 5mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10X) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1X) 500ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
Referencias
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