Lepr<sup> ديسيبل</sup> نموذج الفأر من النوع 2 من مرض السكري: البنكرياس عزل جزيرة وتعيش خلية 2 فوتون التصوير من الجزر سليمة
Summary
We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.
Abstract
داء السكري من النوع 2 هو مرض مزمن يؤثر على 382 مليون شخص في عام 2013، ومن المتوقع أن يرتفع إلى 592،000،000 بحلول عام 2035 1. وخلال العقود الماضية 2، ودور ضعف خلايا بيتا في داء السكري من النوع 2 تم تأسيس بوضوح 2. وقد تطلب تقدم البحوث طرق لعزل الجزر البنكرياسية. بروتوكول للعزلة جزيرة قدم هنا أسهم العديد من الخطوات المشتركة مع البروتوكولات من المجموعات الأخرى، مع بعض التعديلات لتحسين المحصول وجودة من الجزر المعزولة من كل من النوع البري والسكري ديسيبل Lepr (ديسيبل / ديسيبل) الفئران. ثم ويرد الخلية الحية 2-الفوتون طريقة التصوير التي يمكن استخدامها لتحقيق السيطرة على إفراز الأنسولين داخل الجزر.
Introduction
دور ضعف خلايا بيتا في المرض وقد تم الاعتراف على نطاق واسع 3،4. خطوط الخلايا مثل MIN6 وINS-1 هي أدوات مفيدة لفهم بيولوجيا السلوك خلايا بيتا. ومع ذلك، التحكم الفسيولوجية لإفراز الأنسولين تجري داخل جزر لانجرهانز. هذه الجزر تحتوي على الآلاف من خلايا بيتا معبأة بإحكام، وكذلك الأوعية الدموية وغيرها من أنواع الخلايا في الغدد الصماء. هذه البيئة داخل جزيرة يؤثر إفراز الأنسولين، ومن المرجح أن تكون مهمة في مرض السكري. لذلك، لفهم السيطرة الفسيولوجية لإفراز الأنسولين، والفيزيولوجيا المرضية للمرض، فمن الضروري لدراسة الجزر سليمة.
جزيرة العزلة
الجزر الإنسان الحي و، ولا سيما الجزر الإنسان من مرضى داء السكري من النوع 2 ويصعب الحصول عليها. بالإضافة إلى ذلك، الجزر البشرية لديها إمكانيات محدودة للتلاعب الجزيئية التجريبية. لذا استخدم الباحثون هويتيح من الحيوانات والنماذج الحيوانية من مرض السكري من النوع 2. نموذج واحد من هذا القبيل هو مرض الماوس ديسيبل / ديسيبل. هذا هو طفرة تلقائية أن النماذج داء السكري من النوع 2 مع تطور النمط الظاهري الذي يوازي بشكل وثيق الأمراض التي تصيب البشر 5،6. بروتوكول المعروضة هنا للجزيرة بمعزل عن السكري الفئران ديسيبل / ديسيبل لديه العديد من الخطوات المشتركة مع المجموعات الأخرى مع بعض التحسينات لأفضل عائد وتنقية وتعزيز بقاء الجزيرة.
التصوير 2 الفوتون
الخلية الحية فحص 2 الفوتون هو موضح هنا تمكن الباحثين من تحديد عدد وتقييم خصائص الحبيبات التي تحتوي على الانسولين واحدة من العديد من الخلايا من السكري 7 والنوع البري الجزر 8،9.
Protocol
Representative Results
Discussion
العامل الأكثر أهمية في عزلة جزيرة هو نضح الأولي من البنكرياس. وتحت perfused لنتائج البنكرياس في أقل من ذلك بكثير العائد جزيرة. عوامل أخرى تؤثر أيضا على جودة العزل مثل الوقت الهضم ومستوى الهز الذي يمكن أن يعوض جزئيا عن مستوى التروية. على سبيل المثال، سوف تحتاج إلى البنك…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Liberase TL 5mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10X) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1X) 500ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
Referencias
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
- Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
- Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
- Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
- Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
- Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
- Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).
