Роботизированная Производство раковой клетки сфероидов с водной двухфазной системе для тестирования на наркотики
Summary
A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.
Abstract
Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.
Introduction
Клеточные анализы являются важным инструментом для развития и открытия новых лекарств против рака. 1,2 Исторически сложилось так, однослойные культуры раковых клеток были использованы для изучения эффективности соединений-кандидатов против отдельных видов раковых клеток. Простота в обслуживании однослойных культур в стандартных планшетах для культивирования, совместимость стандартных пластин с коммерческими роботов инструментов для добавления реагентов, а также с сортировочного оборудования для нисходящего анализа клеточных реакций на химические соединения основные преимущества, которые делают 2D культурам привлекательный инструмент для тестирования на наркотики. 3 К сожалению, монослой клеток анализы часто не в состоянии предсказать эффективность соединений в естественных условиях, что делает разработки лекарственных препаратов и открытия чрезвычайно дорогостоящий процесс. 4,5 Несмотря на значительные инвестиции и усилия фармацевтических компаний и академических подразделений, только ~ 1% противораковых были утверждены наркотики в клинических испытанияхпо FDA в течение последних двух десятилетий. 6 Неравенство между 2D культур и комплексной среде 3D раковых клеток в естественных условиях является существенным недостатком систем культивирования монослоя. 7 Таким образом, скрининг соединений-кандидатов против опухолевых клеток в условиях, больше напоминает среда опухоли 3D может ускорить разработку новых препаратов химиотерапии. 8
Раковая клетка сфероидов представить соответствующую 3D модель опухоли в пробирке. 9,10 Spheroids компактные кластеры, которые образуют через спонтанного или индуцированного сборки раковых клеток на неприлипающих поверхностях или в суспензии, используя такие методы, как вращающуюся колбу, жидкого наложения, микроизготовленном микро- . также массивы, микрофлюидики и висячей капли 11-16 Spheroids имитировать основные черты твердых опухолей, включая геометрии и ограниченной сети транспорта кислорода, питательных веществ и лекарственных соединений в центральной зоне; следовательно, они более тесно регенерации наркотиков responSE солидных опухолей по сравнению с однослойных культур. 17-19 Несмотря на это заметное выгоды, не используются сферические обычно для скрининга химических соединений против раковых клеток. Трудность получения однородных по размеру сфероидов в стандартной установки с высокой пропускной который совместим с коммерчески доступными робототехники и инструментов скрининга / визуализации препятствует включению сфероида культуры в стадии разработки лекарственного средства. Хотя пользовательские материалы и пластины в последнее время стали коммерчески доступными для удовлетворения этой потребности, соображения экономии сдерживать их широкое применение.
Два основных методов с возможностью получения в соответствии размера сфероидов в высокой пропускной использовать новый висячей капли платформу и микроизготовленном микро-Уэллс. 13,16,20 Однако, оба подхода требуют специальных пластин и устройств, которые являются дорогостоящими для изготовления и неудобно для пользователей конечных точек в основных научно-исследовательских центров и фармацевтической промышленности, где наиболее крупных EFфорты для открытия новых лекарств против рака сделаны. Несмотря на некоторые улучшения в стабильности клеточных-содержащих капли с недавним дизайна свисающими тарелки, только каждый второй отверстие пластины до сих пор используется во время культивирования, чтобы избежать распространения / слияние капель. 16 Это значительно снижает экспериментальный пропускную способность. Добавление наркотиков и возобновление трудно с ручной или роботизированной пипетки и сферические должны быть переданы в стандартной пластины для биохимического анализа, поскольку эта конфигурация панель не легко совместим с обычным сортировочного оборудования, таких как плиты читателей. 21 микро-скважин изготовлены с использованием мягкого литографии также позволяют контролируемого размера сфероид производства. 13,20 Тем не менее, несовместимость этой платформы с помощью стандартных инструментов пипеток предотвращает лечения отдельных сфероидов с различными лекарственных соединений / концентрации, выставляя все сфероидов в одном состоянии обработки. Таким образом, этот способ не подходит для высокогоскрининг соединение, которое требуется одновременное тестирование нескольких соединений / концентрациях.
Чтобы преодолеть эти трудности, новая технология производства за большой пропускной способностью стабильно размера сфероидов раковых клеток в стандартных 96-луночных была разработана. 22,23 подход основан на полимерной водной двухфазной системе (АТП) с полиэтиленгликолем ( ПЭГ) и декстран (DEX) в фазе формирования полимеров. 24 ATPSs недавно были использованы в различных биологических приложений новым клеток, позволяющих клеток micropatterning и локализованной доставки биологических реагентов с клетками в водной среде высокой. 25-32 Для формирования сфероид, раковые клетки смешивают с водной фазой DEX и капли суб-мкл полученной суспензии с помощью пипетки в лунку, содержащую погружения водным раствором ПЭГ фазы. Падение остается не смешивается с этапа погружения и ограничивает клеток для облегчения образования сфероида. Чертенокortantly, высоко водную фазу погружения обеспечивает питательные вещества к клеткам сфероида и минимизирует хорошо известную проблему массовой информации испарения, общий для некоторых других анализов, которые вызывает изменения в медиа-осмотического давления и колебания концентрации препарата. Эта методика дает сфероид производства и медикаментозное лечение только с помощью коммерчески доступных реагентов-пипетки и инструменты в стандартных 96-луночных. Важно отметить, что анализ клеточных ответов сфероидов выполняется в одной и той же пластине с помощью стандартных биохимических анализов и пластины читателей. Простота работы с АТП и приспособляемости подхода к роботизированной обработки жидкого предъявляет высокие поколения пропускная способность как моно-культуры и сотрудничества культуры сфероидов простой лабораторной техники. Этот новый подход будет важным шагом вперед на пути интеграции раковых клеток сфероидов в разработке лекарств и открытий процессов с улучшенными тестирование пропускной способности и экономической эффективности (увеличение числа тестируемых соединений и РедуCED расход реагентов) и эффективность (снижение руки-по времени).
Подробный протокол робота производства раковых клеток сфероидов в 96-луночных планшетах с использованием АТП подход описан ниже. Кроме того, сведения о лекарственной терапии в результате сфероидов и вниз по течению анализа клеточных реакций с использованием коммерческого биохимический анализ представлены.
Protocol
Representative Results
Discussion
Spheroids представить реалистичную модель, чтобы лучше понять физиологию опухоли и эффективность препарата и полезным инструментом для обнаружения наркотиков против рака. Такие приложения могут извлечь большую пользу из простых методов генерации и обслуживания сфероид, когда требуется …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.
Materials
| Reagents and Consumables | |||
| Polyethylene glycol, Mw: 35,000 | Sigma-Aldrich | 94646 | |
| Dextran, Mw: 500,000 | Pharmacosmos | 5510 0500 9007 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| Glutamine | Life Technologies | 35050-061 | |
| Antibiotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Clacein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| Hoechst | Life Technologies | 33342 | |
| Cisplatin | Spectrum Chemicals | 15663-27-1 | |
| PrestoBlue | Life Technologies | A-13261 | |
| Pluronic F-108 | Sigma Aldrich | 542342 | |
| Disposable Tips (10 µl) | Fluotics | C-P10V11.ST | |
| Disposable Tips (70 µl) | Fluotics | C-P70V11.ST | |
| Round-bottom 96-well plates | Corning | 7007 | |
| Equipment | |||
| Liquid Handler | Agilent Technologies | SRT Bravo | |
| Microplate Reader | Biotek Instruments | Synergy H1M |
Referencias
- Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. Systems biology in drug discovery. Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).
- Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. In vitro assays for anticancer drug discovery–a novel approach based on engineered mammalian cell lines. Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).
- Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
- Gidrol, X., et al. 2D and 3D cell microarrays in pharmacology. Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).
- Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK. BMJ Open. 3, (2013).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Ghajar, C. M., Bissell, M. J. Tumor engineering: the other face of tissue engineering. Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).
- Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
- Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).
- Wartenberg, M., et al. Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells. FASEB J. 15, 995-1005 (2001).
- Tekin, H., et al. Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates. Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).
- Patra, B., et al. A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis. Biomicrofluidics. 7, 54114 (2013).
- Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat. Commun. 5, 4250 (2014).
- Hsiao, A. Y., et al. Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates. Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).
- Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).
- Minchinton, A., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumors. Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Jeong, G. S., et al. Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies. Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).
- Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids. JALA. 19, 208-214 (2014).
- Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids. Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).
- Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture. Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).
- Albertsson, P. -. A., Tjerneld, F. Phase diagrams. Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).
- Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Frampton, J. P., et al. Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA. Sci. Rep. 4, 4878 (2014).
- Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions. Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).
- Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system. Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).
- Tavana, H., et al. Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells. Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).
- Tavana, H., et al. Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies. Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).
- Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches. Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).
- Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).
- Kalluri, R., Zeisberg, M. . Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts. BMC Cancer. 10, 444 (2010).
- Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).
- Hsiao, A. Y., et al. Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids. Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).
- Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).
- Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes – bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).
- Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).
