Modelo de ratón de rechazo vascular inducida por aloinmune y Arteriosclerosis Trasplante
Summary
We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure.
Abstract
Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune system of the recipient causes damage of the arterial wall and dysfunction of endothelial cells and smooth muscle cells. This triggers a pathological repair response that is characterized by intimal thickening and luminal occlusion. Understanding the mechanisms by which the immune system causes vasculature rejection and TA may inform the development of novel ways to manage graft failure. Here, we describe a mouse aortic interposition model that can be used to study the pathogenic mechanisms of vascular rejection and TA. The model involves grafting of an aortic segment from a donor animal into an allogeneic recipient. Rejection of the artery segment involves alloimmune reactions and results in arterial changes that resemble vascular rejection. The basic technical approach we describe can be used with different mouse strains and targeted interventions to answer specific questions related to vascular rejection and TA.
Introduction
Durante los últimos 30 años, los avances en los fármacos inmunosupresores han disminuido el rechazo del injerto por rechazo agudo, pero el rechazo crónico sigue siendo un desafío principal. La principal manifestación de rechazo al trasplante cardíaco crónico es la arteriosclerosis del trasplante (TA) 1,2. Esta condición se caracteriza por hiperplasia de la íntima y la disfunción vasomotor de las arterias de aloinjertos y se desarrolla como resultado de la focalización inmunológica de las células musculares lisas y endoteliales por el sistema inmune del destinatario. La orientación específica de la vasculatura del injerto debido al reconocimiento de complejo de histocompatibilidad principal de péptido extranjera (MHC) se pone de relieve por el desarrollo de TA exclusivamente en las arterias de injerto sin afectar los vasos anfitrionas 3. En consonancia con esto es la observación de que la TA no se produce experimentalmente cuando el destinatario es genéticamente idéntico al donante o cuando el receptor carece de células T y B 4. Lesión vascular mediada inmunológicamente y dysfunction hace que el desarrollo de engrosamiento de la íntima y fibrosis, así como la acumulación aberrante de los lípidos y las proteínas ECM, en TA 5. Engrosamiento de la íntima tiende a ser concéntrico a lo largo de todo el árbol arterial 4-6. Pérdida del injerto y la muerte por lo general se producen como consecuencia de la isquemia progresiva como consecuencia de la oclusión luminal de las arterias de aloinjertos 4.
En 1991, Mennander et al. 7 fue pionera en un modelo de interposición aórtica en ratas para modelar TA. Varios grupos han adaptado posteriormente este procedimiento para su uso en ratones. En este modelo, los segmentos aórticos de aloinjertos desarrollan lesiones que tienen características comparables a TA observaron en los trasplantes clínicos. Esto incluye engrosamiento de la íntima que se caracteriza por la acumulación de células de músculo liso como receptores 7 y leucocitos. Durante los últimos 2 décadas este modelo ha sido utilizado para generar importante información sobre los mecanismos de lesión vascular, el rechazo y TA. Puede ser nosotrosed para examinar cuestiones relacionadas con la respuesta inmune y vasculares durante la patología arterial. La elección de los impactos desajuste antígeno la capacidad para hacer frente adecuadamente a estas preguntas.
Trasplante a través de barreras completas MHC permite una evaluación completa de las respuestas inmunes que se sabe que están implicados en el rechazo del trasplante de órganos. Esto incluye el reconocimiento de células CD4 y CD8 T directo y la focalización de extranjera péptido-MHC presentado por células del injerto derivado, CD4 indirecto (y posiblemente CD8) el reconocimiento de células T y la orientación de los aloantígenos de injerto derivado presentados por células presentadoras de antígeno receptor, y anticuerpo reconocimiento mediado de aloantígenos en las superficies celulares vasculares 8. Sin embargo, la respuesta a la lesión vascular en los experimentos completos coincidentes-MHC puede ser diferente que el observado clínicamente. Johnson et al. 9 mostró que, en los injertos de interposición aórticos trasplantados a través de una barrera completa MHC falta de coincidencia, la mayoría delas células de la neoíntima son de origen destinatario y no de origen donante. Esto es diferente que la observada en los trasplantes humanos donde la mayoría de las células del músculo liso de la íntima son de origen donante 9,10. Para tener en cuenta esta limitación, los modelos experimentales alternativos que implican injerto a través de los descalces de antígeno de histocompatibilidad menor importancia se han desarrollado que desencadenan respuestas vasculares que se asemejan más a los observados en el trasplante clínico 11. Si bien estos modelos alternativos permiten conclusiones importantes que hacer con respecto a las respuestas vasculares que impulsan el desarrollo de la asistencia técnica, los procesos inmunológicos que causan rechazo vascular en antígeno de histocompatibilidad menor injertos no coincidentes no completamente re-capitular las que se producen en el ámbito clínico. Por ejemplo, los antígenos menores de histocompatibilidad se reconocen mal por injerto anticuerpos reactivos 12. Teniendo en cuenta las consideraciones anteriores, es importante considerar el questi patológicaal ser examinado en la elección del tipo de desajuste antígeno utilizado en un modelo interposición aórtica. Aquí se describe un protocolo detallado para murino injerto de interposición aórtica. Se describe el injerto de interposición entre los ratones MHC-coincidentes completos pero el mismo protocolo se utiliza para injertar a través de otras cepas de ratón coincidentes antígeno.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos descrito un protocolo para la interposición de injerto aórtico en ratones que es útil para estudiar el rechazo vascular inmunomediada y TA. Este modelo puede ser utilizado para investigar las causas de la TA, así como el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Se ha utilizado en el pasado para establecer un papel esencial de la inmunidad adaptativa, las respuestas de células T citotóxicas, las respuestas efectoras CD4 de células T mediada por citoquinas, y el daño del injerto mediado por anticuerpo…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y Heart and Stroke Foundation de BC & Yukon (JCC).
Materials
| Name | Company | Catalogue | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories, Bar Harbour ME | Strain# 000664 | |
| Balb/cBYJ | Jackson Laboratories, Bar Harbour ME | Strain# 001026 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ mL | Ketalean | DIN 00612316 | |
| Xylazine Injection 20 mg/mL | Rompum | DIN 02169592 | |
| Ketoprofen Injection 100 mg/mL | Anafen | DIN 01938126 | |
| Butorphanol Tartrate injection 10 mg/mL | Torbugesic | DIN 008450000 | |
| Buprenorphine Injection 0.3 mg/mL | Reckitt Benckiser | B.N. 5241 | |
| Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution | Antisedan | DIN 02237744 | |
| Heparin Sodium Injection, USP, 1000 units/mL | McKesson Distribution | DIN 02264315 | |
| Tears naturale ophthalmic ointment | Alcon | DIN 02082519 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| 0.9% Sodium Chloride, sterile | Baxter Corporation | ||
| Lactated Ringer’s solution, sterile | Baxter Corporation | ||
| 0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 mL | Baxter Corporation | ||
| Alcohol Prep Pads | Loris | ||
| Povidone Iodine | Betadine | ||
| Chlorohexidine Gluconate 4% w/v | Germi-Stat | ||
| Black Polyamide Monofilament | AROSurgical Instruments | T4A10Q07 | |
| Suture, 10-0 suture, 70 microns | Corporation | ||
| Blue monofilament suture 5-0, P3 needle | Ethicon | 8698G | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 1cc TB insulin syringe with 28G 1/2 | BD | REF 309309 | |
| 25G 7/8, hypodermic needle | BD | REF 305124 | |
| 27G 1/2, hypodermic needle | BD | REF 305109 | |
| Colibri Retractor- 1.5cm spread 4cm | Fine Science Tools | 17000-04 | |
| S&T CAF-4 Clip applying forceps, without lock | Fine Science Tools | 00072-14 | |
| Supergrip forceps, S&T | Fine Science Tools | 00632-11 | |
| Medical No.5 forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Lexer Baby Scissors | Fine Science Tools | 14078-10 | |
| Micro Adson forceps serrated | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Vannas-Tubingen microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length | Fine Science Tools | 00396-01 | |
| Graefe-forceps, 10cm 1×2 teeth | Fine Science Tools | 11054-10 | |
| Castroviejo with lock and tungsten jaws | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Hot glass bead sterilizer | Inotech 250 | IS-250 – Steri-250 | |
| Non-woven gauzes | Progene | ||
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | ||
| Beard Trimmer | Wahl | ||
| Heating pad | Sunbeam |
Referencias
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