عزل الكريات البيضاء من واجهة الإنسان الأم والجنين
Summary
Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis – the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.
Abstract
يتميز الحمل عن طريق تسلل الكريات البيض في الأنسجة التناسلية وعلى واجهة الأم والجنين (القاعدي الساقط والساقط الجداري). هذه الواجهة هو الموقع التشريحي للاتصال بين الأم وأنسجة الجنين. وبالتالي، فإنه هو موقع المناعية للعمل خلال فترة الحمل. التسلل الكريات البيض في واجهة الأم والجنين دورا أساسيا في غرس والصيانة الحمل، وتوقيت التسليم. ولذلك، فإن الأوصاف المظهرية والوظيفية لهذه الكريات البيض توفر نظرة ثاقبة الآليات التي تؤدي إلى اضطرابات الحمل. وقد وصفت عدة بروتوكولات من أجل عزل التسلل الكريات البيض من القاعدي الساقط والجدارية الساقط. ومع ذلك، فإن عدم الاتساق في الكواشف، والإنزيمات، ومرات من الحضانة يجعل من الصعب مقارنة هذه النتائج. الموصوفة هنا هو نهج الرواية التي تجمع بين استخدام ديس الميكانيكية والأنزيمية لطيفتقنيات ociation للحفاظ على سلامة ونزاهة علامات خارج الخلية والخلايا في الكريات البيض معزولة عن الأنسجة البشرية في واجهة الأم والجنين. وبصرف النظر عن المناعي، زراعة الخلايا، والفرز الخلية، والتطبيقات المستقبلية من هذا البروتوكول عديدة ومتنوعة. بعد هذا البروتوكول، والكريات البيض معزولة يمكن استخدامها لتحديد الحامض النووي والتعبير عن الجينات المستهدفة، في وظائف المختبر الكريات البيض (أي البلعمة، سمية الخلايا وانتشار الخلايا التائية، واللدونة، وما إلى ذلك)، وإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية في واجهة الأم والجنين. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام بروتوكول وصفها، لقد كان هذا المختبر قادرة على وصف الكريات البيض جديدة ونادرة في واجهة الأم والجنين.
Introduction
يتميز الحمل عن طريق ثلاث مراحل متميزة المناعية: 1) غرس والمشيمة المبكرة المرتبطة استجابة الموالية للالتهابات (أي زرع يشبه "جرح مفتوح ')؛ 2) الثلث الثاني من الحمل وأكثر من الثلث الثالث من الحمل عندما يتم تحقيق توازن المناعة من خلال دولة في الغالب مضادة للالتهابات في واجهة الأم والجنين. و3) الولادة، دولة الموالية للالتهابات 1-7. الخلايا المناعية تلعب دورا هاما في تنظيم الاستجابة الالتهابية في واجهة الأم والجنين حيث وفرة والتغيير توطين طوال فترة الحمل 6-9.
في البشر، واجهة الأم والجنين تمثل مساحة الاتصال المباشر بين الأم (الساقط) والجنين (المشيمه أو الأرومة الغاذية) الأنسجة. هذه الواجهة تشمل ما يلي: 1) الجدارية والساقط الذي يبطن تجويف الرحم لم تتم تغطيتها عن طريق المشيمة وهي في تجاورلأجرد المشيمه. و2) القاعدي الساقط، وتقع في لوحة القاعدية من المشيمة حيث غزت من قبل trophoblasts فراغي 10 (الشكل 1). العلاقة الحميمة من هذه المناطق للاتصال تخلق الظروف لتعرض الجنين الأنتيجين إلى الأمهات الجهاز المناعي 11-13. ليس من المستغرب أن الكريات البيض يشكلون ما يقرب من 30-40٪ من الخلايا الساقطية 8،9،14،15 بالإضافة إلى خلايا انسجة من نوع نموذجية والخلايا الغدية 8،14،16. دور الكريات البيض في واجهة الأم والجنين يشمل العمليات المتعددة التي تشمل الحد من الأرومة الغاذية الغزو 17، وتدبير الشرايين دوامة 18،19، والحفاظ على التسامح الأمهات 12،20، والشروع في العمل 21-26. الكريات البيض من كل من التكيف وأطرافه الفطرية في الجهاز المناعي، أي خلايا T، الضامة، وقد تم تحديد العدلات، والخلايا B والخلايا الجذعية، والخلايا القاتلة الطبيعية، في الأنسجة الساقطية، وعلىوقد ثبت النسب وحالة التنشيط تختلف مكانيا وزمانيا طوال فترة الحمل 6-10،12،14،24،27-30. وترتبط اضطرابات في عدد الكريات البيض و / أو وظيفة مع الإجهاض العفوي 31، تسمم الحمل 32، وزن الولادة 32،33، والخدج العمل 7،24. ولذلك، فإن دراسة الصفات المظهرية وظيفة الكريات البيض في واجهة الأم والجنين البشري تسهيل توضيح من مسارات المناعية dysregulated في اضطرابات الحمل.
واحدة من أقوى الأدوات المستخدمة لتحديد النمط الظاهري وخصائص وظيفية من الكريات البيض والتدفق الخلوي والتكنولوجيا التي تسمح للتحليل الكمي للمعلمات متعددة في وقت واحد 34-36. لتحليل الكريات البيضاء التي التدفق الخلوي، مطلوب عزل الكريات البيض في تعليق وحيد الخلية. لذلك، وهي طريقة لفصل التسلل ليووهناك حاجة kocytes من واجهة الأم والجنين لدراسة المظهرية وخصائصها الوظيفية.
وقد وصفت عدة طرق لعزل الكريات البيض من واجهة الأم والجنين البشري 10،14،25،27،37-39. في حين أن بعض تطبيق تصنيف الميكانيكية 10،25،27،38، والبعض الآخر يستخدم الهضم الأنزيمي 37،40 لتفكك الأنسجة. لأن تفصيل الميكانيكية تنتج العائد أقل وانخفاض الجدوى 41، وتفارق الأنزيمية يمكن أن تؤثر على سلامة وسطح الخلية الاحتفاظ علامة 42، الأسلوب هو موضح هنا يجمع بين التفكك الميكانيكية لطيف مع الأنزيمية ما قبل المعالجة لزيادة الغلة من الكريات البيض معزولة دون المساس بقاء الخلية. وقد تجلى مزيج مماثل من الطرق لتكون فعالة في عزل الكريات البيض من أنسجة الساقطية في واجهة الأم والجنين 39. ولذلك، فإن بروتوكول الموصوفة هنا ينطوي ميكاتصنيف nical مع dissociator الأنسجة التلقائي الذي يزيد من الاتساق مع توفير الوقت والعمل بالمقارنة مع تنميق التقليدي مع معارضة المشارط، شفرات الحلاقة، أو مقص جراحي 10،28. كان الإنزيم الذي تم اختياره لتفكك النسيج Accutase. على عكس كولاجيناز تستخدم عادة 43، dispase 44، والتربسين 45، Accutase (حل مفرزة الخلية) يجمع بين بروتين العام وأنشطة حال الكولاجين التي تسهم في كفاءة تفارق بعد لطيف 46،47. بعد التفكك، وإثراء الكريات البيض من مجموع السكان من الخلايا الساقطية التي كتبها التدرج الكثافة الطرد المركزي. وقد وسائل الإعلام المختلفة الكثافة التدرج تستخدم في السابق، والأكثر شيوعا منها Percoll (تعليق جسيمات السيليكا الغروية) 48 و Ficoll (البوليمر من السكروز مع ارتفاع الوزن الجزيئي الاصطناعية) 49. وكانت كفاءة متفوقة من العزلة التي فرضها البوليمر السكروز previoأظهرت usly 50، والبروتوكول وصفها أيضا هنا يثبت أن هذه الوسائط التدرج الكثافة تنتج نقاء عالية بما فيه الكفاية من الكريات البيض وحيدات النوى.
وبالتالي، فإن بروتوكول الموصوفة هنا يجمع بين تصنيف الأنسجة الميكانيكية مع dissociator التلقائي الأنسجة، والهضم الأنزيمي مع حل مفرزة الخلية، وفصل الكريات البيض مع وسائل الإعلام التدرج الكثافة (1.077 + 0.001 غ / مل) لعزل الكريات البيض من أنسجة الساقطية الإنسان. وقد ثبت هذا البروتوكول للحفاظ على مستضدات سطح الخلية مع بقاء الخلية. الكريات البيض معزولة يمكن استخدامها لتطبيقات متعددة تشمل المناعي مع التدفق الخلوي والدراسات الفنية في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
توصيف الخصائص الفنية والمظهرية لالتسلل الكريات البيض في واجهة الأم والجنين البشري ضروري لفهم الآليات المناعية التي تؤدي إلى اضطرابات الحمل. وقد وصفت عدة تقنيات من أجل عزل الكريات البيض من واجهة الأم والجنين البشري طوال فترة الحمل 10،14،25،28،37،42،43. ومع ذلك، كل هذ…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل معهد كينيدي شرايفر يونيس الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية، NIH / DHHS. وأيد هذا العمل أيضا، في جزء منه، من خلال مبادرة جامعة واين ستيت في فترة ما حول الولادة صحة الأم وفترة ما حول الولادة وصحة الطفل. نحن نعترف بامتنان مورين McGerty (جامعة ولاية واين) لها قراءات نقدية للمخطوطة.
Materials
| Dissection | |||
| Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers | Any vendor | 20012-027 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | (1X PBS) | |
| Large and small Petri dishes | Any vendor | ||
| Dissociation | |||
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (cell detachment solution) |
| Sterile 2 mL safe-lock conical tubes | Any vendor | ||
| 50 mL conical centrifuge tubes | Any vendor | ||
| 100 µm cell strainers | FALCON/Corning | 352360 | |
| 5 mL round bottom polystyrene test tubes | Any vendor | ||
| Transfer pipettes | Any vendor | ||
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Cell Culture | |||
| RPMI culture medium 1640 | Life Technologies | 22400-089 | (1X) (10% FBS and 1% P/S) |
| Plastic chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Incubator | Thermo Scientific Corporation | HEPA Class 100 | |
| Water bath | Fisher Scientific | ISOTEMP 110 | |
| Cell counter | Nexelcom | Cellometer Auto2000 | |
| Microscope | Olympus | Olympus CKX41 | |
| Cell Separation | |||
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 30μm pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
| Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15mL safe-lock conical tubes | Any Vendor | ||
| MACS buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| FcR Blocking | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | (Fc Block) |
| Anti-human cell surface antigen antibodies | BD Biosciences | (Table 1) | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| LIVE/DEAD viability dye | BD Biosciences | 564406 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Biosciences | 346202 | |
| FACS buffer | (1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS) | ||
| Staining buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| Trypan Blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250-011 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | 20% density gradient media |
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSR-Fortessa | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | SpinChron DLX | |
| Vacuum system | Any vendor | ||
| Automatic tissue dissociator | Miltenyi Biotec | gentleMACS Dissociator |
Referencias
- Kelly, R. W. Inflammatory mediators and parturition. Rev Reprod. 1 (2), 89-96 (1996).
- Keelan, J. A., et al. Cytokines, prostaglandins and parturition–a review. Placenta. 24, S33-S46 (2003).
- Romero, R., et al. Inflammation in preterm and term labour and delivery. Semin Fetal Neonatal Med. 11 (5), 317-326 (2006).
- Norman, J. E., Bollapragada, S., Yuan, M., Nelson, S. M. Inflammatory pathways in the mechanism of parturition. BMC Pregnancy Childbirth. 7, S7 (2007).
- Mor, G., Cardenas, I. The immune system in pregnancy: a unique complexity. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 425-433 (2010).
- Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Bulmer, J. N., Morrison, L., Longfellow, M., Ritson, A., Pace, D. Granulated lymphocytes in human endometrium: histochemical and immunohistochemical studies. Hum Reprod. 6 (6), 791-798 (1991).
- Bulmer, J. N., Williams, P. J., Lash, G. E. Immune cells in the placental bed. Int J Dev Biol. 54 (2-3), 281-294 (2010).
- Sindram-Trujillo, A., Scherjon, S., Kanhai, H., Roelen, D., Claas, F. Increased T-cell activation in decidua parietalis compared to decidua basalis in uncomplicated human term pregnancy. Am J Reprod Immunol. 49 (5), 261-268 (2003).
- Red-Horse, K., et al. Trophoblast differentiation during embryo implantation and formation of the maternal-fetal interface. J Clin Invest. 114 (6), 744-754 (2004).
- Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
- Christiansen, O. B. Reproductive immunology. Mol Immunol. 55 (1), 8-15 (2013).
- Vince, G. S., Starkey, P. M., Jackson, M. C., Sargent, I. L., Redman, C. W. Flow cytometric characterisation of cell populations in human pregnancy decidua and isolation of decidual macrophages. J Immunol Methods. 132 (2), 181-189 (1990).
- Trundley, A., Moffett, A. Human uterine leukocytes and pregnancy. Tissue Antigens. 63 (1), 1-12 (2004).
- Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression. Biol Reprod. 52 (3), 609-615 (1995).
- Rango, U. Fetal tolerance in human pregnancy–a crucial balance between acceptance and limitation of trophoblast invasion. Immunol Lett. 115 (1), 21-32 (2008).
- Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
- Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy, ., B, Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
- Thomson, A. J., et al. Leukocytes infiltrate the myometrium during human parturition: further evidence that labour is an inflammatory process. Hum Reprod. 14 (1), 229-236 (1999).
- Young, A., et al. Immunolocalization of proinflammatory cytokines in myometrium, cervix, and fetal membranes during human parturition at term. Biol Reprod. 66 (2), 445-449 (2002).
- Osman, I., et al. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Mol Hum Reprod. 9 (1), 41-45 (2003).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biol Reprod. 86 (2), 39 (2012).
- Gomez-Lopez, N., et al. Evidence for a role for the adaptive immune response in human term parturition. Am J Reprod Immunol. 69 (3), 212-230 (2013).
- Hamilton, S. A., Tower, C. L., Jones, R. L. Identification of chemokines associated with the recruitment of decidual leukocytes in human labour: potential novel targets for preterm labour. PLoS One. 8 (2), e56946 (2013).
- Sindram-Trujillo, A. P., et al. Differential distribution of NK cells in decidua basalis compared with decidua parietalis after uncomplicated human term pregnancy. Hum Immunol. 64 (10), 921-929 (2003).
- Repnik, U., et al. Comparison of macrophage phenotype between decidua basalis and decidua parietalis by flow cytometry. Placenta. 29 (5), 405-412 (2008).
- Sanguansermsri, D., Pongcharoen, S. Pregnancy immunology: decidual immune cells. Asian Pac J Allergy Immunol. 26 (2-3), 171-181 (2008).
- Houser, B. L. Decidual macrophages and their roles at the maternal-fetal interface. Yale J Biol Med. 85 (1), 105-118 (2012).
- Tamiolakis, D., et al. Human decidual cells activity in women with spontaneous abortions of probable CMV aetiology during the first trimester of gestation. An immunohistochemical study with CMV-associated antigen. Acta Medica (Hradec Kralove). 47 (3), 195-199 (2004).
- Williams, P. J., Bulmer, J. N., Searle, R. F., Innes, B. A., Robson, S. C. Altered decidual leucocyte populations in the placental bed in pre-eclampsia and foetal growth restriction: a comparison with late normal pregnancy. Reproduction. 138 (1), 177-184 (2009).
- Eide, I. P., et al. Serious foetal growth restriction is associated with reduced proportions of natural killer cells in decidua basalis. Virchows Arch. 448 (3), 269-276 (2006).
- Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques. J Vis Exp. (38), (2010).
- Jaso, J. M., Wang, S. A., Jorgensen, J. L., Lin, P. Multi-color flow cytometric immunophenotyping for detection of minimal residual disease in AML: past, present and future. Bone Marrow Transplant. 49 (9), 1129-1138 (2014).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Isolation and functional studies of granulated lymphocytes in first trimester human decidua. Clin Exp Immunol. 77 (2), 263-268 (1989).
- Nagaeva, O., Bondestam, K., Olofsson, J., Damber, M. G., Mincheva-Nilsson, L. An optimized technique for separation of human decidual leukocytes for cellular and molecular analyses. Am J Reprod Immunol. 47 (4), 203-212 (2002).
- Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Chapter 7. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. (UNIT 7.40), 41-11 (2012).
- Soares, M. J., Hunt, J. S. Placenta and trophoblast: methods and protocols overview II. Methods Mol Med. 122, 3-7 (2006).
- Ritson, A., Bulmer, J. N. Extraction of leucocytes from human decidua. A comparison of dispersal techniques. J Immunol Methods. 104 (1-2), 231-236 (1987).
- White, H. D., et al. A method for the dispersal and characterization of leukocytes from the human female reproductive tract. Am J Reprod Immunol. 44 (2), 96-103 (2000).
- Maruyama, T., et al. Flow-cytometric analysis of immune cell populations in human decidua from various types of first-trimester pregnancy. Hum Immunol. 34 (3), 212-218 (1992).
- Zhang, J., et al. Isolation of lymphocytes and their innate immune characterizations from liver, intestine, lung and uterus. Cell Mol Immunol. 2 (4), 271-280 (2005).
- Carlino, C., et al. Recruitment of circulating NK cells through decidual tissues: a possible mechanism controlling NK cell accumulation in the uterus during early pregnancy. Blood. 111 (6), 3108-3115 (2008).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
- Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
- Snegovskikh, V. V., et al. Intra-amniotic infection upregulates decidual cell vascular endothelial growth factor (VEGF) and neuropilin-1 and -2 expression: implications for infection-related preterm birth. Reprod Sci. 16 (8), 767-780 (2009).
- Oliver, C., Cowdrey, N., Abadia-Molina, A. C., Olivares, E. G. Antigen phenotype of cultured decidual stromal cells of human term decidua. J Reprod Immunol. 45 (1), 19-30 (1999).
- Chang, Y., Hsieh, P. H., Chao, C. C. The efficiency of Percoll and Ficoll density gradient media in the isolation of marrow derived human mesenchymal stem cells with osteogenic potential. Chang Gung Med J. 32 (3), 264-275 (2009).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
