Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten
Summary
We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.
Abstract
Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.
Introduction
Rasterkraftmikroskopie (AFM) erzeugt ein Bild einer Oberfläche durch Abtasten über einen Bereich der Probe unter Verwendung eines Auslegers mit einer sehr scharfen Spitze 1. Die Bewegung des Auslegers tastet die Oberflächentopologie der Probe. AFM wurde weithin an biologische Moleküle aufgebracht – einschließlich Proteinen, DNA und Membranen, die aufgrund ihrer Flexibilität bei der Analyse von festen Proben in Luft oder nahezu native Zustand in flüssiger 2-5.
Abgesehen von seiner hochauflösenden Imaging-Fähigkeit im Nanometerbereich, wirkt der AFM Cantilever als Feder, um Wechselwirkungskräfte (Adhäsion und Repulsion) und mechanischen Eigenschaften der Probe 5,6 sondieren. Dies wird als Kraftspektroskopie bekannt. In diesem Modus wird zuerst nähert die Sonde die Probe und übt eine Kraft auf, dann zurückgezogen wird, bis er den Kontakt verliert mit der Probe (1A). Die erzeugten Kurven zeigen Kraft als Funktion der Entfernung des Auslegers sowohl für den AppRotauge und Einfahren. Mehrere Objekte einschließlich des Elastizitätsmoduls, die Steifigkeit eines Materials zu messen, und Adhäsionskräfte ableiten.
Unterstützte Lipid-Doppelschichten sind biologische Modellmembranen auf einem festen Träger liegend – in der Regel Glimmer, Borosilikatglas, Quarzglas, oder oxidierten Silizium 7. Sie werden mit verschiedenen Techniken wie Vesikel Abscheidung hergestellt, Langmuir-Blodgett-Verfahren und Spin-Coating 8,9. AFM verwendet wurde, um die Bildung dieser abgestützt Doppelschichten 10 zu folgen, und der Sonde unterschiedliche Strukturen von Membranen unterschiedlicher Zusammensetzungen 11-15 gebildet.
Darstellende Kraftspektroskopie auf unterstützten Doppelschichten führt zu einer Spitze in der Ansatz-Kurve. Dieser Peak zeigt die Kraft, die benötigt, um die Doppelschicht zu durchdringen, und heißt Durchbruch Kraft. Die Doppelschichtdicke kann auch über die Kraftkurve 6 gemessen werden. Die typische Durchbruchkraft von DoppelschichtenBereich zwischen 1-50 nN 6. Diese Eigenschaften hängen von Lipidpackung (flüssig oder Gelphase) und Struktur (Acylkettenlänge und Grad der Ungesättigtheit) von membranaktiven Mittel 16 verändert. Die Theorie hinter dem Bruch wurde erläutert, 17 und andere experimentelle Parameter wie Cantilever Weichheit, Spitzenradius und Annäherungsgeschwindigkeit auch die bahnbrechende Kraft 15,16,18 beeinflussen. Kraftspektroskopie wurde verwendet, um die Eigenschaften der verschiedenen Lipidphasen 11,19, Zusammensetzung abhängigen Änderungen 12,20 sowie Wirkungen anderer Biomoleküle wie Peptide zu analysieren, auf die Stabilität der Membran 21.
Die flache Orientierung unterstützt Doppelschichten ist für die Kombination von AFM mit anderen Verfahren wie Oberflächenplasmonresonanz 22 und der Fluoreszenzmikroskopie 11,19 eine bessere Charakterisierung Struktur und die Eigenschaften von Membranen vorteilhaft.
Diese ausführliche Video protocol soll unterstützten Lipiddoppelschichten bereiten Vesikel mit Abscheidung und mit AFM und Kraftspektroskopie zu analysieren. Während Vesikel in verschiedenen Größen verwendet werden, um Doppelschichten herzustellen, konzentriert sich dieses Protokoll auf kleinen und großen unilamellaren Vesikeln. Unterstützte Doppelschichten, die in flüssige Phase bestellt (L o) und flüssige ungeordneten (L d) Phasentrennung wurden 11,15 aus. 2: 1-Verhältnis die Membran aus Di-oleoyl-phosphatidylcholin (DOPC), Sphingomyelin (SM) und Cholesterin (Chol) bei 2 besteht. Diese Zusammensetzung Modelle die Lipid Rafts, die vorgeschlagen werden, um als Plattform für wichtige Proteintransport und Sortierung, Zellsignalisierung und andere zelluläre Prozesse 23,24 verhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
SLBs composed of DOPC:SM:Chol (2:2:1) were formed on mica after vesicle adsorption and rupture induced by calcium chloride. This lipid composition separated into Ld and Lo phases. The Lo phase is enriched in sphingomyelin and cholesterol and is less fluid/more viscous (Figure 1A) than the Ld phase11. The separation of Lo from Ld phase manifests as circular structures elevated above the surrounding (Figure 1B, C)…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Max Planck Society, the German Cancer Research Center, the University of Tübingen, and the Bundesministerium für Bildung und Forschung (grant no. 0312040).
We thank Eduard Hermann for helping us automate the analysis of the force curve data and Dr. Jakob Suckale for careful reading of this manuscript.
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850375P | Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Sphingomyelin (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 860062P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Sodium chloride (NaCl), 99.8% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 9265.1 | |
| Potassium chloride (KCl), 88% | Sigma | P9541 | |
| Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% | AppliChem GmbH | A1046 | |
| Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904.1 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade | AppliChem GmbH | A4689 | |
| HEPES, molecular biology grade | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Glass coverslip, 24×60 mm, 1mm thickness | Duran Group | 2355036 | |
| Mica blocks | NSC Mica Exports Ltd. | These are mica pieces at least 1 sq. Inches in area and thickness randing from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set. Always handle mica with gloves or tweezers. | |
| Punch and Die Set | Precision Brand Products, Inc | 40105 | |
| Optical Adhesive | Norland Products, Inc. | NOA 88 | Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. |
| Laboratory Equipment Grease | Borer Chemie AG | Glisseal N | |
| Liposome Extruder | Avestin | LiposoFast-Basic | As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc. |
| Adhesive Tape | 3M | Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch) | |
| Bath Sonicator | Bandelin Sonorex Digitec | DT-31 | No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf |
| Silicon Nitride AFM Cantilever | Bruker AFM Probes | DNP-10 | Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m. |
| AFM | JPK | JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200 |
Referencias
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
- Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology. Science. 242, 209-216 (1988).
- Gaczynska, M., Osmulski, P. A. AFM of biological complexes: What can we learn. Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).
- Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -. C., Longo, M. L. AFM for structure and dynamics of biomembranes. BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).
- Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).
- Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F., Baró, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. . Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications. , (2012).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
- Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. Atomic Force Microscopy of Biological Membranes. Biophys. J. 96, 329-338 (2009).
- Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
- Raviakine, I., Brisson, A. R. Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy. Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).
- Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. . ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).
- Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics. Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).
- Domènech, &. #. 2. 1. 0. ;., Sanz, F., Montero, M. T., Hernández-Borrell, J. Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane. BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).
- Domènech, &. #. 2. 1. 0. ;., Morros, A., Cabañas, M. E., Teresa Montero, M., Hernández-Borrell, J. Supported planar bilayers from hexagonal phases. BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).
- Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes. J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).
- Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation. Biophys. J. 103, 38-47 (2012).
- Butt, H. -. J., Franz, V. Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory. Physical Review E. 66, 031601 (2002).
- Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy. Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).
- Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study. Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).
- Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes. Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).
- García-Sáez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM. Biophys. J. 93, 103-112 (2007).
- Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques. Nanoscale. 1, 40-49 (2009).
- Simons, K., Vaz, W. L. C. Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1. Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).
- Pike, L. J. Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function. The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).
- Kahya, N. Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
- Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation and applications. Nanoscale Research Letters. 8, 102 (2013).
- Butt, H. -. J., Jaschke, M. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).
- Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids. Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).
- Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).
- Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).
- Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).
- Lee, M. -. T., Chen, F. -. Y., Huang, H. W. Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides. Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).
- Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration. The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).
- Nichols-Smith, S., Teh, S. -. Y., Kuhl, T. L. Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes. BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).
- Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration. Phys. Rev. Lett. 98, (2007).
- Rigaud, J. -. L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).
