<em> במבחנה</em> מודל למדידה של מערכת חיסונית למלריה בהקשר של HIV Co-זיהום
Summary
Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.
Abstract
Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood.
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility.
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.
Introduction
שיתוף זיהום, דלקת עם זיהומים במקביל מרובים, היא הנורמה בסביבות טבעיות. שיתוף זיהום יכול להיות השפעה גדולה על פתולוגיה מחלה ועל הניהול הקליני של כל זיהום. בהקשר של שיתוף זיהום, חיסון ויעילות תרופה, כמו גם בדיקות אבחון, יכול להיות מושפע באופן שלילי (בדיקה ב 1). עם זאת, למרות חשיבותה, רוב מחקר הפתוגן רואה זיהומים רק אחת.
מלריה וHIV-1 (HIV) מובילות גורמים לתחלואה ותמותה בעולם. תחומי מלריה והאיידס endemicity לשתף חפיפה גיאוגרפית רחבה, לשים מיליוני אנשים בסיכון לשיתוף זיהום וכתוצאה מכך בסיכון למחלות קליניות חמורות יותר 2 – 10. שתי המחלות אינטראקציה שלילית. באנשים שנדבקו ב- HIV, עומס נגיפי HIV גבוה וירידות זמניות בספירת CD4 + T-cell ניתן לראות בהידבקות במלריה, ואילונטל טפיל מלריה וסיכון של מלריה קלינית וחמורה הם גבוהים יותר אצל אנשים שנדבקו בשיתוף 2,3,5,7,8,10. המנגנונים שבאמצעותם HIV מגביר את חומרת מלריה אינם מובנים במלואם ולהצדיק חקירה נוספת.
כאן אנו מתארים שיטה שבאמצעותה מלריה ושיתוף זיהום HIV ניתן ללמוד במבחנה. באופן ספציפי, שיטה זו מאפשרת לבחינת תגובות חיסוני מלריה ספציפית בהקשר של זיהום HIV. הפרוטוקול שלנו מתאר מערכת תכליתית שיתוף תרבות שימוש בתאי הדם היקפיים mononuclear מבודדים טרי (PBMCs) מבודדת מכרוני תורמים נגועים ב- HIV ובמבחנת פ התרבותי falciparum parasitized אריתרוציטים (PfRBC). ההשפעה של טיפול התרופתי HIV על תגובות אלה יכול להיות גם נבחנה באמצעות PBMCs מכאן ולהבא שנאסף מאיידס (+) מראש תורמים ולאחר טיפול.
יש לנו בשימוש במערכת זו כדי לחקור את ההשפעה של זיהום HIVבתגובה חיסונית מולדת מלריה ספציפית 11,12, והצליחה לקבוע כי תגובות IFNγ וTNF מלריה ספציפית לקויים בתאי NK, תאי NKT, γδ תאי T מאיידס (+) מראש תורמים ופוסט-HIV טיפול תרופתי . בנוסף, היינו יכול להשתמש במערכת זו כדי לקבוע כי פונקציות monocytic גם לקויים באיידס (+) תורמים, אבל להתאושש לאחר HIV טיפול תרופתי.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול שלנו כבר מותאם כדי ביותר מציאותי ללמוד שיתוף זיהום HIV-מלריה במבחנה. ראשית, RBCs אדם טרי וסרום נדרשים לתרבות טפיל מלריה. זה חיוני כדי להשיג אוכלוסייה בריאה של טפילי מלריה. lysates טפיל לא ניתן להחליף לטפילי חיים כייצור ציטוקינים הוא הרבה יותר מהיר ואינטנסיבי ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.A.M.F. and L.S. participated in protocol design, acquisition and analysis of data, and drafting of the article.
The authors wish to thank Dr. Kain, Dr. Loutfy, Dr. Wasmuth, and Dr. Ayi for their contributions.
C.F. was supported by a CTN/Ontario HIV Treatment Network (OHTN) postdoctoral fellowship. L.S. is supported by an OHTN Junior Investigator Development Award. The present work was supported by a Canadian Institutes of Health Research (CIHR) operating grant (MOP-13721 and 115160), and a CIHR New Investigator Catalyst grant.
Materials
| alanine | Sigma | A7377 | |
| antibodies (see other table) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm with BD GolgiPlug | BD | 555028 | includes brefeldin A, cytofix/cytoperm buffer and perm/wash buffer |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodium Heparin | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (no calcium, no magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | heat inactivate before use |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamycin (10mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Staining Set | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| Ionomycin | Sigma | I3909 | |
| MEM non-essential amino acids (10mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 powder | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine and HEPES | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| sodium bicarbonate (powder, cell culture) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Pyruvate (100mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Trypan Blue (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | depends on antibodies used |
| Parasite Gas Mixture | By special order | 3% CO2, 1% O2, balance N2 |
Referencias
- Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
- French, N., et al. Increasing rates of malarial fever with deteriorating immune status in HIV-1-infected Ugandan adults. AIDS (London, England). 15 (7), 899-906 (2001).
- Hoffman, I. F., et al. The effect of Plasmodium falciparum malaria on HIV-1 RNA blood plasma concentration. AIDS (London, England). 13 (4), 487-494 (1999).
- Kamya, M. R., et al. Effect of HIV-1 infection on antimalarial treatment outcomes in Uganda: a population-based study. The Journal of infectious diseases. 193 (1), 9-15 (2006).
- Kublin, J. G., et al. Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study. Lancet. 365 (9455), 233-240 (2005).
- Mermin, J., et al. Effect of co-trimoxazole prophylaxis, antiretroviral therapy, and insecticide-treated bednets on the frequency of malaria in HIV-1-infected adults in Uganda: a prospective cohort study. Lancet. 367 (9518), 1256-1261 (2006).
- Patnaik, P., et al. Effects of HIV-1 serostatus, HIV-1 RNA concentration, and CD4 cell count on the incidence of malaria infection in a cohort of adults in rural Malawi. The Journal of infectious diseases. 192 (6), 984-991 (2005).
- Whitworth, J., et al. Effect of HIV-1 and increasing immunosuppression on malaria parasitaemia and clinical episodes in adults in rural Uganda: a cohort study. Lancet. 356 (9235), 1051-1056 (2000).
- Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha. The Journal of infectious diseases. 177 (2), 437-445 (1998).
- Francesconi, P., et al. HIV, malaria parasites, and acute febrile episodes in Ugandan adults: a case-control study. AIDS (London, England). 15 (18), 2445-2450 (2001).
- Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates Tim-3 expression on innate cells: combination antiretroviral therapy results in partial restoration. Journal of acquired immune deficiency syndromes. 63 (2), 161-167 (2013).
- Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates innate immunity to malaria despite combination antiretroviral therapy. AIDS (London, England). 27 (3), 325-335 (2013).
- Ljungstrom, I., et al. . Methods in Malaria Research. , (2013).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-DDCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hensmann, M., Kwiatkowski, D. Cellular basis of early cytokine response to Plasmodium falciparum. Infection and immunity. 69 (4), 2364-2371 (2001).
- Artavanis-Tsakonas, K., Riley, E. M. Innate immune response to malaria: rapid induction of IFN-gamma from human NK cells by live Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. J Immunol. 169 (6), 2956-2963 (2002).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. The Journal of parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Ludlow, L. E., et al. HIV-1 inhibits phagocytosis and inflammatory cytokine responses of human monocyte-derived macrophages to P. falciparum infected erythrocytes. PloS one. 7 (2), e32102 (2012).
- Weinberg, A., et al. Viability and functional activity of cryopreserved mononuclear cells. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (4), 714-716 (2000).
- Fowke, K. R., Behnke, J., Hanson, C., Shea, K., Cosentino, L. M. Apoptosis: a method for evaluating the cryopreservation of whole blood and peripheral blood mononuclear cells. Journal of immunological. 244 (1-2), 139-144 (2000).
- Jeurink, P. V., Vissers, Y. M., Rappard, B., Savelkoul, H. F. J. T cell responses in fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells: kinetics of cell viability, cellular subsets, proliferation, and cytokine production. Cryobiology. 57 (2), 91-103 (2008).
- Kvarnström, M., Jenmalm, M. C., Ekerfelt, C. Effect of cryopreservation on expression of Th1 and Th2 cytokines in blood mononuclear cells from patients with different cytokine profiles, analysed with three common assays: an overall decrease of interleukin-4. Cryobiology. 49 (2), 157-168 (2004).
- Venkataraman, M. Effects of cryopreservation of immune responses. XI. Heightened secretion of tumor necrosis factor-alpha by frozen human peripheral blood mononuclear cells. Cryobiology. 34 (3), 276-283 (1997).
- Venkataraman, M. Effects of cryopreservation on immune responses. X. Decrease in interleukin-12 production by frozen human peripheral blood mononuclear cells is mediated by the endogenously hypersecreted interleukin-10. Cryobiology. 33 (5), 581-588 (1996).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (3), 352-359 (2000).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. Journal of leukocyte biology. 56 (3), 236-240 (1994).
