Preparação de Mica e silício substratos para análise do DNA Origami e Experimentação

Summary

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Abstract

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Introduction

Introduzido pela primeira vez em 2006, origami de DNA utiliza a natureza de auto-montagem de oligonucleótidos de DNA para produzir nanoestruturas designable e altamente ordenados. ¹ Uma miríade de estruturas têm sido relatados, que vão desde as caras do smiley travada para caixas em 3 dimensões. ² origami de DNA pode ser funcionalizada com várias biomoléculas e nanoestruturas, dando origem a aplicações de investigação no domínio da nanoelectrónica, medicina e computação quântica. ³ No entanto, a análise e muitas aplicações futuras não são apenas dependente de concepção estrutural, mas também com a adesão das nanoestruturas origami de DNA em superfícies. Os métodos descritos neste manuscrito dizem respeito à preparação de amostras de ADN origami em dois tipos de substratos: mica e óxido de silício funcionalizado.

A mica é o substrato de escolha para estudos origami ADN porque é atomicamente plana, com uma altura de camada de 0,37 nm ± 0,02 nm. ⁴ É também easily limpo, tornando a preparação de amostras e microscopia de força atômica (AFM) estudos simples. Mica moscovite contém uma alta densidade de potássio em cada plano de clivagem, mas estes iões difundem para longe da superfície da mica quando em água. Para mediar a ligação de origami de DNA para o substrato de mica, Mg ²⁺ é usado para inverter a carga negativa da mica e se ligar electrostaticamente a espinha dorsal de fosfato do ADN para o substrato (Figura 1A). ⁵ As misturas de DNA emparelhado na presença de grande excessos de fios de grampos dar cobertura elevada e boas imagens em mica, porque a adesão de origami de DNA para Mg ²⁺ superfície do terminadas em é muito mais forte do que a adesão de oligonucleotídeos de cadeia simples (vertentes descontínuas). Outros iões carregados positivamente, incluindo Ni e Co ^{2+ 2+} pode ser utilizada para controlar a aderência de ADN em mica. ^6,7 Alterar a concentração de catiões monovalentes e divalentes em solução pode mediar Adhetaxas de Sion e difusão superfície de origami de DNA. ⁸ No entanto, o protocolo para a preparação de substratos de mica e depositando e lavar o origami é muitas vezes não explicitamente descritos nos manuscritos publicados ^9. Sem um protocolo claro, boa reprodutibilidade dos resultados pode ser difícil de obter.

A mica é um isolador, para que ele não é adequado como um substrato para algumas aplicações em nanoelectrónica. Silicon passivado com um óxido nativo fina tem propriedades eletrônicas desejáveis, incluindo a compatibilidade com o processamento antes de cortesia semicondutor de óxido metálico (CMOS) para criar estruturas de entrada / saída e características topográficas. Bolachas de silício são armazenados ao ar com passivado ou um óxido térmico de espessura ou película fina de óxido nativo que é relativamente sujo, com um elevado número de partículas. Óxido de silício tem uma muito mais baixa densidade de carga de superfície do que a mica, e a densidade de carga é altamente dependente de óxido de preparação e da história. Em concentrações de íons de magnésio above 150 mM, boas coberturas (até 4 / uM ²⁾ de origami de DNA rectangular pode ser alcançado em substratos de silício de plasma tratado de oxigénio; no entanto, esta concentração e a cobertura pode mudar dependendo do tamanho e design das nanoestruturas a ser utilizado. ¹⁰ Um protocolo alternativo para ajustar a carga de superfície é para anexar uma monocamada auto-montada catiónico de 3-aminopropiltrietoxissilano (APTES) (Figura 1B) para o óxido. A amina primária na APTES pode ser protonado a valores de pH inferiores a 9, modificando a carga e hidrofobicidade do substrato. ¹¹ Para uma monocamada completa de APTES a ser depositada com sucesso, o silício deve ser adequadamente limpo usando Radio Corporation of America (RCA) protocolos . Esses protocolos incluem tratamentos em hidróxido de amónio e soluções de peróxido de hidrogênio (RCA1) para remover resíduos orgânicos e contaminantes de partículas. Um curto etch em solução aquosa de ácido fluorídrico remove a camada de óxido nativo juntamente comquaisquer contaminantes iónicos que aderem ao óxido. Finalmente, as amostras são expostas a um ácido clorídrico e solução de peróxido de hidrogénio (RCA2) para remover o metal e contaminantes iónicos e formar uma camada fina de óxido, uniforme. ¹² A maioria das salas limpas, designaram capuzes de protocolos de limpeza CMOS, com regras estritas sobre o que pode ser usada nestas áreas. Um problema comum vem sob a forma de íons tais como o sódio, o que pode perturbar as propriedades eletrônicas de estruturas CMOS criando armadilhas midbandgap. ¹³ íons comumente usado em origami de DNA de preparação e de deposição buffers poderia contaminar os banhos de CMOS e causar problemas para outros pesquisadores que utilizam o quarto limpo. Por esta razão, o nosso grupo utiliza um CMOS 'sujos' limpeza banco organizados especificamente para as pequenas amostras utilizadas para a investigação origami de DNA. Este processo é uma boa alternativa para a sala limpa tradicional set-up e pode ser adequado para laboratórios que não têm acesso a um banco de CMOS de sala limpa.

Protocol

1. Experiência Planejamento e preparação do material Determinar o desenho, a concentração, ea funcionalidade do origami de DNA que vai ser usado nas experiências 14-16. Aqui, utilizamos um design ADN origami rectângulo preparado em 1x TAE / Mg 2+ (40 mM de base Tris, 20 mM ácido acético, EDTA 2 mM e acetato de magnésio 12 mM, pH 8,0). 17 Autoclave todas as dicas, tubos e recipientes para ser usado. Estes materiais devem ser todos autoclave compatível. </li…

Representative Results

Duas variáveis ​​ditar a cobertura de origami de DNA sobre o substrato: concentração da solução e do tempo de exposição. As características de adsorção de origami ADN sobre mica e APTES óxido de silício funcionalizados foram anteriormente relatados. 13 A relação entre a concentração de origami de DNA na solução de deposição e as coberturas finais sobre mica estão resumidos na Tabela 1 e Figura 2, que mostra os resultados de concentração crescentes n…

Discussion

Há vários passos que precisam ser enfatizados para atingir resultados consistentes e ideais. Para amostras de mica, após uma lavagem rigorosa e minuciosa e que secam regime, como nos passos 3.3 e 3.4, vai assegurar que as imagens de origami de DNA indivíduo de alta qualidade pode ser alcançada usando AFM sem os vários problemas descritos na seção Resultados Representante. De primordial importância para as amostras de silício é a limpeza do substrato. Seguindo os procedimentos de limpeza descritas na etapa 5.2…

Materials

Eppendorf epT.I.P.S. Reloads, capacity 2-200 μL	VWR International, LLC	22491733	10 reload tray of 96 tips
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene	VWR International, LLC	87003-290	0.65 mL, natural
Research Plus Pippete – Single Channel – 20-200 μL	A. Daigger & Company, Inc.	EF8960F-3120000054 EACH	Adjustable Volume
Research Plus Pippete – Single Channel – 2-20 μL	A. Daigger & Company, Inc.	EF8960D-3120000038 EACH	Adjustable Volume
Scotch 237 Permanent Double-Sided Tape	Office Depot, Inc.	602710	3/4" x 300", Pack of 2
Vortex Mixer	Thermo Scientific	M37610-33Q
Wafer container single, 2" (50 mm), 60 mm x 11 mm	Electron Microscopy Sciences	64917-2	6 per pack
6" Wafer, P-type, <100> orientation, w/ primary flat	Nova Electronic Materials, Ltd.	GC49266
Powder-Free Nitrile Examination Gloves	VWR International, LLC	82062-428	Catalog number is for size large
High Accuracy Noncontact probes with Au reflective coating	K-Tek Nanotechnology, Inc.	HA_NC/15
Autoclave Pan	A. Daigger & Company, Inc.	NAL692-5000 EF25341C
Sol-Vex II Aggressive Gloves, Size: 9-9.5; 15 mil, 13 inch – 1 dz	Spectrum Chemical Mfg. Corp.	106-15055	Before use, rinse with water and scrub together until no bubbles form on the gloves.
Tweezers PTFE 200 mm Square	Dynalon Corp.	316504-0002
Muscovite Mica Sheets V-5 Quality	Electron Microscopy Sciences	71850-01	10 per pack
Mica Disc, 10 mm	Ted Pella, Inc	50	Mica discs are optional
Scriber Diamon Pen for Glassware	VWR International, LLC	52865-005
Scintillation Vials, Borosilicate Glass, with Screw Cap – 20 mL	VWR International, LLC	66022-060	Case of 500, with attached polypropylene cap and pulp foil liner
4 x 5 Inch Top PC-200 Hot Plate, 120 V/60 Hz	Dot Scientific, Inc.	6759-200
Straight-Sided Glass Jars, Wide Mouth	VWR International, LLC	89043-554	Case of 254, caps with pulp/vinyl liner attached
Standar-Grade Glass Beaker, 250 mL Capacity	VWR International, LLC	173506
Beakers, PTFE	VWR International, LLC	89026-022	For use with HF
Shallow form watch glass, 3"	VWR International, LLC	66112-107	Case of 12
Plastic Storage Container	VWR International, LLC	470195-354	For secondary container
General-Purpose Liquid-In-Glass Thermometers	VWR International, LLC	89095-564
High precision and ultra fine tweezers	Electron Microscopy Sciences	78310-0
Polycarbonate Faceshield	Fisher Scientific, Inc.	18-999-4542
Neoprene Apron	Fisher Scientific, Inc.	19-810-609
Calcium Gluconate, Calgonate	W.W Grainger, Inc.	13W861	Tube, 25 g
Hydrogen Peroxide 30 % CR ACS 500 mL	Fisher Scientific, Inc.	H325 500	HARMFUL, TOXIC
3-Aminopropyltriethoxysilane	Gelest Inc.	SIA0610.0-25GM	Let warm to room temperature before use.
Ammonium hydroxide, 2.5 L	Fisher Scientific, Inc.	A669-212	HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid	Fisher Scientific, Inc.	A144-212	HARMFUL, TOXIC
Hydrofluoric acid	Fisher Scientific, Inc.	A147-1LB	HARMFUL, TOXIC
MultiMode Nanoscope IIIa	Veeco Instruments, Inc.	n/a	Any AFM capable of tapping mode is suitable for analysis
Dunk basket	Made in lab	Made in lab	The dunk basket was made using the bottom of a PTFE bottle with holes drilled in, PTFE handle, and all PTFE screws.