Immunofluorescence indirecte sur des coupes congelées de glande mammaire de souris

Summary

Le protocole d'immunofluorescence indirecte décrite dans cet article permet la détection et la localisation de protéines dans la glande mammaire de la souris. Procédé complète est donnée pour préparer des échantillons de la glande mammaire, pour effectuer l'immunohistochimie, l'image de coupes de tissus par microscopie à fluorescence, et de reconstruire des images.

Abstract

L'immunofluorescence indirecte est utilisé pour détecter et localiser des protéines d'intérêt dans un tissu. Le protocole présenté ici décrit un procédé simple et complet pour la détection de protéines immunitaire, la souris glande mammaire en lactation étant pris comme exemple. Un protocole de préparation des échantillons de tissu, en particulier en ce qui concerne la dissection de la glande mammaire de la souris, la fixation du tissu et la coupe de tissu congelé, sont décrites en détail. Un protocole standard pour effectuer immunofluorescence indirecte, y compris une étape de récupération de l'antigène en option, est également présenté. L'observation des coupes de tissus marqués ainsi que l'acquisition de l'image et post-traitements sont également indiqués. Cette procédure donne une vue d'ensemble, à partir de la collection de tissus d'origine animale pour la localisation cellulaire d'une protéine. Bien que ce procédé général peut être appliqué à d'autres échantillons de tissu, elle doit être adaptée à chaque couple d'anticorps de tissu / primaire étudié.

Introduction

La glande mammaire est un organe exocrine mammifère atypique dont la fonction principale est de produire du lait pour nourrir les nouveau-nés. Le développement du tissu mammaire survient principalement après la naissance et se caractérise par un processus unique dans lequel l'épithélium envahit le stroma environnant. Ce tissu subit de nombreux changements (croissance, la différenciation et de régression), en particulier au cours de la vie adulte, de manière concomitante avec des variations dans l'état reproducteur (Figure 1). En plus de la morphologie globale du tissu, les proportions des différents types de cellules, ainsi que leur disposition à l'intérieur de la glande mammaire changer de façon spectaculaire au cours du développement ^5.1.

Au cours de la vie embryonnaire, l'épithélium mammaire dérive de lignes de lait mammaires, qui est défini par un léger épaississement et la stratification de l'ectoderme, entre les parties avant et arrière des membres de chaque côté de la ligne médiane autour jour embryonnaire 10,5 (de E10.5) (Figure 1A ).Sur E11.5, la ligne de lait se décompose en placodes individuels, qui sont positionnés de manière symétrique le long de la ligne de lait mammaire en des emplacements reproductibles, et le mésenchyme environnant commence à se condenser. Les placodes commencent à sombrer plus profondément dans le derme et le mésenchyme mammaire organise en couches concentriques autour du bourgeon mammaire (E12.5-E14.5). Comme de E15.5, l'épithélium mammaire, commence à proliférer et allongé pour former le germe primaire qui pousse à travers le mésenchyme mammaire vers le coussinet adipeux. Le germe primaire développe un lumen creux avec une ouverture sur la peau, caractérisée par la formation de la gaine du mamelon. Sur a 18,5, le conduit allongeant a grandi dans le coussinet de graisse et a ramifié dans un petit système canalaire arborisée englobé dans le coussinet adipeux. Développement est essentiellement arrêté et la glande mammaire reste rudimentaire morphogenetically repos jusqu'à la puberté. Dans l'embryon mâle, l'activation des récepteurs androgènes conduit à la dégénérescence des bourgeons, qui disparaissentpar E15.5. Comme de E18, le développement mammaire cesse jusqu'à la puberté ^6-9.

À la naissance, la glande mammaire abrite un système canalaire rudimentaire qui allonge et les branches lentement (croissance isométrique). Au début de la puberté, les structures sphériques situés aux extrémités des conduits appelés les bourgeons terminaux (TEBS), sont formées d'une couche externe de cellules de la coiffe et une âme interne multicouche de cellules (cellules de l'organisme). Ces structures sont très proliférative et infiltrent le tissu stromal environnante en réponse aux signaux hormonaux. Prolifération dans les résultats TEBS d'allongement canalaire, couplé avec la morphogenèse de ramification. Ce processus conduit à la mise en place d'un réseau arborisée épithéliale de base émanant de la tétine (figure 1B, la puberté). A ~ 10-12 semaines après la naissance, lorsque l'épithélium envahi tout le a coussinet adipeux, son expansion et arrête le TEB disparaître. Le développement de Ductal subit alors des modifications dynamiques, à savoir, successive la prolifération et la régression des cellules épithéliales selon des cycles oestraux ¹⁰ (figure 1B, adultes).

Dès le début de la gestation, le tissu mammaire subit une croissance importante et des changements morphologiques pour se préparer à l'allaitement. L'épithélium mammaire largement proliférer et se différencier, ce qui conduit à un réseau tubulo-alvéolaire hautement ramifié. En même temps, les cellules epitheliales mammaires (CEM) deviennent polarisés et capable de synthétiser et sécréter des produits laitiers. CEM organisent en de nombreuses structures alvéolaires (de acini) qui sont entourés par des cellules myoépithéliales contractiles et incorporés dans un stroma composée de tissus conjonctifs et adipeux, les vaisseaux sanguins et les terminaisons nerveuses (figure 1B, la grossesse). En outre, le côté basal de CEM est en contact étroit avec la membrane basale (de la matrice extracellulaire), et les interactions entre ces deux entités réguler étroitement à la fois fonction de la morphogenèse et sécrétoire de la mamanry épithélium ^11-13.

Tous ces procédés reposent sur l'action de divers signaux de l'environnement, dont les plus importants sont les facteurs paracrines hormones14, et la matrice extracellulaire. Par exemple, la progestérone induit étendue latérale de ramification ¹⁵ et alveologenesis qui, en combinaison avec la prolactine (PRL) ^16,17, favorise et entretient la différenciation des alvéoles. En plus de stéroïdes et PRL18, les cytokines et les voies de signalisation associées au développement (Wnt et Notch voies de signalisation) sont également impliqués dans l'engagement de la lignée mammaire et le développement ^19-21. À la fin de la grossesse, les CEM luminal commencent à produire un lait riche en protéines connu sous le nom de colostrum dans la lumière des alvéoles. En outre, la progestérone agit sur la perméabilité épithéliale et depuis les jonctions serrées sont encore ouverts, le colostrum est également trouvé dans la circulation sanguine maternelle.

Après l'accouchement, la mammarépithélium y occupe la quasi-totalité du volume de la glande mammaire et est hautement organisée (Figure 2, l'épithélium mammaire). Unités productrices de lait, à savoir les alvéoles (Figure 2, alvéole), sont formés par une monocouche de cellules épithéliales mammaires sécrétoires polarisées (de mESCs), avec leur membrane plasmique apicale délimitant la lumière. Alvéoles se disposent en lobules qui sont regroupés en lobes reliés à des conduits qui drainent le lait au milieu extérieur (Figure 2, lobe). Allaitement se produit, ie., MESCs commencent à sécréter des quantités abondantes de lait, déclenchées principalement par la baisse des hormones placentaires (principalement la progestérone) (figure 1B, lactation). Les gènes de protéines de lait sont activés dans un cours à temps temporelle définie allant de la grossesse à l'allaitement ^9,22,23, principalement en réponse à PRL pituitaire publié au moment de la tétée. Parallèlement, les contacts entre mESCs et la matrice extracellulaire de protéines de lait à la fois stimuler Synthesis par des signaux qui sont médiés par les interactions entre les intégrines cellulaires et laminine ^24,25, et suppriment l'apoptose dans mESCs ^26,27. Ces voies de signalisation donnent lieu à l'activation des protéines de lait ^{de 28} promoteurs de gènes par le biais de l'activation de facteurs de transcription spécifique ^29. Contacts cellule-cellule sont également importants pour certains aspects de la différenciation, y compris l'établissement de la polarité apicale et la sécrétion vectoriel de produits laitiers. Jonctions serrées rapidement fermer après le début de la lactation et mESCs orchestrer finement l'absorption de molécules dans le sang ainsi que la synthèse, le transport et la sécrétion des composants du lait, en réponse aux besoins nutritionnels des nouveau-nés. Au moment de la tétée, la contraction des cellules myoépithéliales entourant les alvéoles se produit en réponse à l'ocytocine et conduit à l'éjection du lait à travers les conduits et dans le mamelon. Le lait est un liquide complexe qui contient des protéines (surtoutcaséines), des sucres (lactose principalement), des lipides et des minéraux, ainsi que des molécules bioactives telles que des immunoglobulines A (IgA), des facteurs de croissance et hormones. Les caséines sont synthétisés, assemblés en structures supramoléculaires, à savoir les micelles de caséine, transportés le long de la voie sécrétoire, et ensuite libérés par exocytose, à savoir la fusion des vésicules de sécrétion contenant de la caséine (SV) avec la membrane plasmique apicale des MESC (figure 2).

Trafic intracellulaire repose sur les échanges de matériels entre les compartiments membranaires et implique Soluble N-éthylmaléimide sensible Fusion (NSF) Attachment Protein (SNAP) Receptor (SNARE) ^30,31. La famille des protéines SNARE est subdivisé en SNAREs vésiculaires (v-SNARE), présents dans la membrane des vésicules, et des pièges cibles (t-SNARE), localisés sur les membranes cibles. Par zipping à travers leurs domaines coiled-coil, V- et t-SNARE assemblent pour former un complexe de faisceau à quatre hélices hautement stable, dénommé ecomplexe SNARE e. Ce complexe favorise la fusion de deux bicouches lipidiques opposées en les amenant progressivement à proximité immédiate ^30,32. Ensuite, complexes SNARE sont dissociées par l'adénosine triphosphatase NSF et ses protéine adaptatrice protéines SNAP et le filet, sont recyclés à leur compartiment d'origine ^33. Fait intéressant, chaque protéine SNARE réside principalement dans les compartiments cellulaires distincts et SNARE appariement peut contribuer à la spécificité des événements intracellulaires ³⁴ de fusion. Des études antérieures suggèrent qu'au moins 23 protéines (SNAP23) et associée à la vésicule Membrane Protein 8 (VAMP8), et syntaxins (STX) Synaptosomal associée -7 et -12 jouent un rôle dans la caséine exocytose ^35,36. Ces protéines ont également été trouvés en association avec la fraction lipidique du lait, à savoir, matière grasse du lait globules (MFG) ^37. Le modèle qui prévaut courant postule que les gouttelettes lipidiques cytoplasmiques (CLD) sont formées par l'accumulation de l neutreipids (principalement des triglycérides et des esters de sterol) et cholestérol dérivé de l'alimentation maternelle entre les deux feuillets du réticulum endoplasmique (ER) ^{de 38 à 41} membrane. Pour les CLD sont formées, au moins en partie, par la fusion de petites CLD pendant son transport vers le côté apical de mESCs où ils sont libérés en tant que MFG (1-10 um de diamètre) par bourgeonnement, étant enveloppé par la membrane plasmique apicale des MESC ^40-42. Allaitement cesse après petits sont sevrés et les mESCs meurent progressivement par apoptose, conduisant à la régression du tissu mammaire à un état ​​pubertaire (figure 1B, l'involution).

Immunofluorescence (IF) est une méthode de laboratoire analytique commun utilisé dans presque tous les aspects de la biologie, à la fois dans la recherche et en diagnostic clinique. Si les techniques peuvent être effectuées sur des coupes de tissus (immunohistochimie, IHC) ou cellulaires (immunocytochimie, CPI) échantillons. Cette approche puissante repose sur l'utilisation de fluorescent-des anticorps marqués qui se lient spécifiquement (directement ou indirectement) à l'antigène d'intérêt, permettant ainsi la visualisation de sa distribution dans les tissus par microscopie de fluorescence. Les signaux de fluorescence dépendent principalement de la qualité et la concentration des anticorps et la manipulation de l'échantillon. Un protocole simple immunofluorescence indirecte (IIF) est présenté pour détecter les produits de lait (caséines et MFG) et des protéines impliquées dans la sécrétion de lait produit (butyrophiline (BTN1), caisse claire protéines) sur des sections congelées de tissu mammaire de la souris (Figure 3). Bien que ce protocole fournit un aperçu complet IHC, allant de la collecte de tissus à l'image de post-traitement, critique et des étapes facultatives ainsi que quelques recommandations techniques sont également présentés et discutés.

Protocol

Souris CD1 ont été élevés à l'INRA (UE0907 IERP, Jouy-en-Josas, France). Tous les aspects éthiques du soin des animaux conformes aux lignes directrices et aux exigences d'octroi de licences prévues par le ministère français de l'Agriculture. Les procédures utilisées ont été approuvées par le comité d'éthique local (accord 12/097 du Comethea Jouy-en-Josas / AgroParisTech). 1. glande mammaire Préparation d'échantillons Souris glande mam…

Representative Results

La glande mammaire est une glande sous-cutané situé le long de la structure à la fois ventrale du thorax et de l'abdomen chez les rongeurs. L'emplacement des cinq paires de glandes de la souris pendant la gestation est montré dans la figure 4. La morphologie de la glande mammaire change radicalement au cours de son développement, reflétant des modifications fonctionnelles requises pour préparer la lactation complète (figure 1B). Chez les ani…

Discussion

IHC est une méthode expérimentale relativement simple et directe pour localiser l'antigène dans des sections de tissus, qui dépend principalement sur les interactions épitope-anticorps spécifiques. Bien qu'un grand nombre de protocoles sont utilisés pour localiser une protéine par IIF, l'âme de ces procédures est presque toujours le même. Cependant, il ya certains aspects critiques qui peuvent fortement influencer le résultat et doivent donc être optimisés pour chaque étude IHC individu. L&#39…

Materials

Dissection	Company	Catalog Number	Comments/Description
Pins
Ethanol
Scissors
Scalpel and adapted blades
Ice
Towel paper
Tissue sample preparation	Company	Catalog Number	Comments/Description
Phosphate Buffered Saline (pH7.4)	Sigma	P-3813
Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)	Electron Microscopy Sciences	15714-S	personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer
OCT compound/Tissue Tek	Sakura	4583
Sucrose (D-saccharose)	VWR	27480.294
Plastic molds	Dominique Dutscher	39910
Liquid nitrogen
Cryostat/sample support	Leica	CM3050S
Razor blades (SEC35)	Thermo Scientific	152200
Slide box
Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus	Thermo Scientific	10143560W90/1014356190
Brushes
IHC	Company	Catalog Number	Comments/Description
Super Pap Pen	Sigma	Z377821-1EA
Permanent marker (black)
50 mM NH4Cl in PBS	Sigma	A-0171
0.1 M glycine in PBS	VWR	24403.367
Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6
Heater (up to 100°C)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7906-100G
Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI	Vector Laboratories	H-1000/H-1200
Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)	VWR	CORN2980-225
Nail polish
Primary antibodies	Company	Catalog Number	Comments/Description
Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)	generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences Center, USA)
Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)	Biolegend (Covance)	MMS-162P
Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)	Thermo Scientific	MS-115-P0/P1
Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)	generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)
Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)	generously gifted S. Tooze (Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)
Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)	Abcam	ab3348
Secondary antibodies	Company	Catalog Number	Comments/Description
Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-025-003
Counterstains	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bodipy 493/503	Life Technologies (Molecular Probes)	D-3922
DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)	Life Technologies (Molecular Probes)	D-1306
Observation/Image capture	Company	Catalog Number	Comments/Description
conventional fluorescence microscope	Leica Leitz DMRB microscope		Standard filters for FITC, Rhodamine and DAPI emissions,                     ×63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), CellˆF software (Olympus)
Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)	Zeiss LSM 510 microscope		Plan-Apochromat ×63 oil-immersion objective (NA 1.4),                  CLSM 510 software,               Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)
Image treatment	Company	Catalog Number	Comments/Description
ImageJ 1.49k software			Free software