Generazione di cancro alla prostata del paziente Derivato modelli di xenotrapianto di cellule tumorali circolanti
Summary
This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.
Abstract
Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.
Introduction
Paziente xenotrapianti derivati sono modelli sperimentali sempre più popolari utilizzati per la ricerca sul cancro. Essi possono essere utilizzati per la caratterizzazione di biomarcatori e percorsi biologici, valutazione preclinica di efficacia dei farmaci, e la creazione di avatar per terapie antitumorali personalizzate 1,2. In precedenza, altri gruppi di ricerca hanno sviluppato modelli PDX o impiantando o iniettando sospensioni di cellule tumorali singole o espianti intero tumore in topi immunocompromessi 1. Questi PDX modelli richiedono raccolta chirurgica del tumore solido fresco, ascite maligna o versamento pleurico da un paziente sottoposto ad un intervento chirurgico che è sia costoso e espone il paziente ad un aumentato rischio di morbilità iatrogena.
Un recente sviluppo significativo nella ricerca sul cancro è stato il rilevamento, l'isolamento e la caratterizzazione di cellule tumorali circolanti. Queste cellule tumorali sfuggono dalla massa tumorale primaria e in circolodove giocano un ruolo critico nella metastasi e recidive, la causa più comune di cancro legato mortalità 3. La valutazione e la caratterizzazione di CTC da diversi tipi di tumori solidi hanno fornito informazioni cliniche per la diagnosi, la prognosi e il monitoraggio malattia residua 3. Una varietà di approcci attualmente utilizzati basandosi su entrambe le proprietà fisiche, espressione di marcatori o caratteristiche funzionali di CTC può essere utilizzata per isolare efficacemente CTC 4. Esistenti macroscala metodi di isolamento CTC includono gradiente di densità centrifugazione, filtrazione fisica con pori del filtro e la separazione contro molecole di superficie. Le metodologie di isolamento CTC più utilizzati sono basati sulla cattura a base di anticorpi di CTC. Sia selezione positiva e negativa di marcatori di superficie cellulare può essere impiegato per isolare CTC dal sangue periferico. Selezione positiva per CTC nella circolazione periferica utilizza comunemente marcatori epiteliali (ad esempio, EpCAM), che unre espresso sulle CTC, ma le cellule non ematopoietiche. Lo svantaggio di questo metodo è che CTCs con potenziale metastatico sono spesso sottoposti epiteliali-to-mesenchymal transizione (EMT), che downregulates marcatori di superficie epiteliali 3. Per isolare CTC con potenziale metastatico, una metodologia di selezione negativa che impiega il marcatore di superficie ematopoietiche, CD45, per esaurire la popolazione normale di cellule di leucociti può essere usato 5.
Il cancro alla prostata è il tumore più comunemente diagnosticato e una delle principali cause di decessi correlati al cancro negli uomini 6. I meccanismi di progressione del tumore e l'aggressività sono state comprese e quindi la generazione e caratterizzazione di modelli sperimentali che ricapitolano l'eterogeneità molecolare del cancro alla prostata sono di notevole interesse. Modelli PDX di carcinoma della prostata sono stati generato in precedenza da attecchimento delle cellule del cancro alla prostata umano in immunocomtopi promesso 7,8. Tuttavia, la generazione di tali modelli è stata ostacolata dal tasso attecchimento basso di cancro alla prostata in topi immunocompromessi, che viene principalmente attribuito alla natura indolente della malattia. Recentemente, CTC sono stati utilizzati per generare il cancro al seno 9, il cancro del polmone 10 e il cancro alla prostata 11 modelli PDX. Questi studi proof-of-concept introdotto la possibilità di generare modelli PDX indipendente dalla necessità di raccolta dei campioni chirurgici. In questo articolo si descrive in dettaglio un metodo per la generazione di questo modello sperimentale romanzo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo manoscritto descrive un metodo per la generazione di cancro della prostata modelli PDX da CTC. L'uso di CTC per la generazione di PDX modelli ha diversi vantaggi potenziali importanti rispetto ai metodi esistenti. Innanzitutto, raccolta accessibile delle CTC dal sangue periferico consente la generazione di modelli sperimentali dallo stesso paziente a diversi stadi della malattia. In secondo luogo, la raccolta di sangue rappresenta un metodo sicuro ed economico per isolare le cellule tumoral…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Jordi Ochando from the Flow Cytometry Shared Resources at the Mount Sinai Medical Center for their assistance in flow cytometry analysis. We thank Dr. Rumana Huq from the Microscopy Shared Resource Facility at the Mount Sinai Medical Center for their imaging assistance. The authors thank the TJ Martell Foundation for its support in this project.
Materials
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Cell Gro | 21-031-CM | |
| 35 µm Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml polystyrene conical tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| DAPI | Invitrogen | d3571 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440 | |
| 12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap | BD Falcon | 352235 | |
| BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA | |||
| BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge | |||
| BD Vacutainer One Use Needle Holder | |||
| Disposable Latex Tourniquet | |||
| Latex or non-latex gloves | |||
| alcohol swabs | |||
| 2×2 cotton gauze pads | |||
| Adhesive bandage | |||
| 25 gauge needle | |||
| 1 ml syringe |
Referencias
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