Überwachung Endoplasmatischen Reticulum Calciumhomöostase Mit ein<em> Gaussia</em> Luciferase SERCaMP
Summary
Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.
Abstract
Das endoplasmatische Retikulum (ER) enthält, die höchste Stufe von intrazellulärem Calcium, wobei Konzentrationen etwa 5000-fach größer als cytoplasmatische Ebenen. Strenge Kontrolle über ER Calcium ist zwingend notwendig für die Proteinfaltung, Änderung und Menschenhandel. Perturbationen ER Calcium kann in der Aktivierung des ungefalteten Protein-Reaktion, einer dreipoligen ER Stressantwort Mechanismus führen und tragen zur Pathogenese einer Vielzahl von Erkrankungen. Die Fähigkeit, ER Kalzium Veränderungen während der Krankheit Beginn und Fortschreiten zu überwachen ist wichtig, im Prinzip, dennoch schwierig in der Praxis. Derzeit verfügbare Verfahren zur Überwachung von ER Calcium, wie Calcium-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffe und Proteine, Einsicht in ER Calciumdynamik in Zellen bereitgestellt, aber diese Werkzeuge sind nicht für in-vivo-Studien geeignet. Unserem Labor haben gezeigt, dass eine Modifikation des Carboxyterminus von Gaussia-Luciferase vermittelt die Sekretion des Reporters in Reaktion aufER Kalzium Erschöpfung. Die Verfahren zur Verwendung einer Luciferase beruht, sezerniert ER Calciumüberwachungsprotein (SERCaMP) zum in vitro und in vivo-Anwendungen werden hier beschrieben. Dieses Video zeigt Leber Injektionen, pharmakologische Manipulation von Gluc-SERCaMP, Blutentnahme und Verarbeitung, und Assay-Parameter für Längs Überwachung der ER Kalzium.
Introduction
Das endoplasmatische Retikulum (ER) Funktionen in vielen Zellkapazitäten einschließlich Proteinfaltung, Proteinsekretion Lipidhomöostase und intrazelluläre Signal 1. Von zentraler Bedeutung für normale ER-Funktion wird beibehalten Lumencalciumkonzentrationen bei ~ 5.000 Mal jene im Zytoplasma 2-4 gefunden. Dieser energieintensive Prozess wird durch die sarco / endoplasmatischen Reticulum Calcium ATPase (SERCA), eine Pumpe, die Calcium-Ionen in das ER bewegt geregelt. Efflux von Kalzium aus dem ER wird hauptsächlich durch den Ryanodin (RyR) und Inositol-Triphosphat (IP3R) -Rezeptoren vermittelt werden. Da viele ER Prozesse sind abhängig von Kalzium, kann stören den Speicher, um ER Stress und schließlich zum Zelltod führen.
ER Calcium Dysregulation in Krankheiten wie Kardiomyopathie, Diabetes, Alzheimer beobachtet und Parkinson-5. Infolge der Progressivität dieser Krankheiten wurde schwierig, die Ursache-Wirkungs-Wieder abgrenzenhung zwischen Pathogenese und Veränderungen in der ER Kalziumspeicher. Eine Anzahl von Technologien für signifikante Fortschritte im Verständnis der ER Calciumdynamik, einschließlich Farbstoffe und genetisch kodierte Calciumindikatoren (GeCIS) erlaubt. Geringe Affinität Calcium-Farbstoffe, die in der Fluoreszenz zu erhöhen, wenn Ca 2+ gebunden ist, kann in die Zellen geladen werden, um subzellulären Kompartimenten mit hohen Konzentrationen an Calcium 6 zu untersuchen. GeCIS wie D1ER und Catcher ermöglichen Überwachung Calciumschwankungen genauere Steuerung der subzellulären Lokalisation 7-9. Vor kurzem hat eine weitere Klasse von GeCIS sogenannter Kalziummess Organell eingeschlossenen Proteinindikatoren (CEPIA) beschrieben worden sind 10. Ein dritter Ansatz, der Genetik und der Chemie kleiner Moleküle ist gezielte Esterase-Farbstoffbeladung (TED), die eine genetisch kodierte Carboxylesterase (zum ER gezielte) mit einem Ester-basierten Calcium Farbstoff 11 verwendet.
Während der AFORementioned Ansätze haben inhärenten Stärken und Schwächen, können sie wertvolle Einblicke in ER Kalziumdynamik durch akute Fluoreszenzmessungen bereitzustellen. Sie sind jedoch für die Langzeitstudien oft erforderlich, um den Krankheitsverlauf zu untersuchen nicht optimal. Mit dem Ziel der Entwicklung einer Methode zur Calciumdynamik über längere Zeiträume hinweg zu beobachten, wurde identifiziert und entwickelt eine Proteinmodifikation, die sezerniert ER Calcium Überwachung Proteine (SERCaMPs) 12 zu schaffen.
SERCaMP umgeht einige Einschränkungen mit anderen Methoden verbunden sind, durch die Bereitstellung einer minimal-invasiven Ansatz, um wiederholt zu verhören die ER Kalziumspeicher. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Carboxy-terminalen Peptids ASARTDL (Alanin-Serin-Alanin-Arginin-Threonin-Asparaginsäure-Leucin) ausreicht, um ER-Retentions fördern; jedoch unter Bedingungen, die Abnahme der ER Calcium verursachen kann, ist die Peptidsequenz nicht mehr ER localizatio behaltenn und das Protein sekretiert 13. Die Basis der SERCaMP Technologie ist das Anhängsel ASARTDL zum Carboxy-Terminus eines sezernierten Proteins (zB Gaussia-Luciferase oder Gluc), so dass die Sekretion von ER Calciumverarmung ausgelöst, wodurch eine robuste Reporter ER Calcium Dysregulation 12. Die Expression von Gluc-SERCaMP über transgene Methoden können biologische Flüssigkeiten wie Zellkulturmedium und Plasma, um Änderungen der Gluc-Aktivität als Indikator für die ER Calciumhomöostase analysiert werden. Das Verfahren findet Anwendung für die Langzeitstudie über progressive Veränderungen in der ER Calciumspeicher sowohl in vitro als auch in vivo. Das folgende Protokoll wird als eine allgemeine Übersicht zur Verwendung von Gluc-basierte SERCaMP zu ER Calciumhomöostase studieren geschrieben, aber das Protokoll kann als Leitfaden für alternative Reporter SERCaMPs dienen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll hebt die in vitro und in vivo Nützlichkeit Gluc-SERCaMP Erschöpfung der ER Calcium zu überwachen. Obwohl die Proteinmodifikation, um SERCaMP erzeugen scheint auf andere Reporter-Proteine 12 verallgemeinern, wählten wir Gaussia-Luciferase für seine robusten (200-1000-fach größer) Biolumineszenz im Vergleich zu anderen Luciferasen 18. Wir zeigen, nachweisbar Thapsigargin-induzierte Gluc-SERCaMP Mitteilung über einen 100-fachen Dosisbereich von Gluc-SER…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program at the National Institute on Drug Abuse. We thank Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno, and Josh Hinkle for their contributions to developing this method.
Materials
| 1.5mL tubes | Fisher | 02-682-550 | |
| 10% NP-40 solution | Pierce | 28324 | for intracellular GLuc assays |
| 1mL luer-lok syringes | Fisher | 14-823-30 | |
| 200uL filter tips | Rainin | RT-L200F | |
| 3-0 surgical sutures | Fisher | NC9598192 | |
| 30g needles | Fisher Scientific | 14-821-13A | |
| Adhesive microplate sealing sheets | Thermo | AB-0558 | |
| Alcohol prep pads | Fisher | 22-246-073 | |
| Anesthesia Auto Flow System | E-Z Anesthesia | EZ-AF9000 | |
| Animal recovery chamber | Lyon Vet | ICU-912-004 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Betadine solution | Fisher | NC9386574 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Bovine growth serum | Thermo | SH30541.03 | |
| Coelenterazine, Native | Regis Technologies | 1-361204-200 | |
| Cotton tipped applicators | Puritan | 806-WC | |
| Cutting needles 3/8 circle sutures | WPI | 501803 | |
| Digital ultrasconic cleaner | Fisher Scientific | FS60D | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate | Life Technologies | 10569-010 | |
| DNA mass ladder | Life Technologies | 10496-016 | |
| Gaussia luciferase (recombinant protein) | Nanolight | 321-100 | |
| Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) | New England Biolabs | E8023S | 1:2000 (WB) |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | DS-401 | |
| Gluc assay plates (96 well, opaque) | Fisher | 07-200-589 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Heparin | Allmedtech | 63323-276-02 | |
| Isoflurane | Butler Schein | 29404 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Kwik Stop Styptic powder | Butler Schein | 5867 | |
| L-glutamine | Sigma | G8540 | |
| Methanol | Fisher | a452-4 | |
| Microfuge 22R Centrifuge | Bekman Colter | 368831 | |
| Neosporin | Fisher | 19-898-143 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nikon Stereoscope | Nikon | SMZ745T | |
| Nucleospin Gel and PCR Cleanup | Machery-Nagel | 740609 | |
| P200 pipet | Rainin | L-200XLS+ | |
| p24 Lenti-X rapid titer kit | Clontech | 632200 | |
| PCR film seal | Fisher | AB0558 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| ReFresh Charcoal Filter canister | E-Z Anesthesia | EZ-258 | |
| Scalpel blades, #10 | Fine Science tools Inc | 10010-00 | |
| SD rats 150-200g | Charles River | Rats | rats ordered at 150-200g. Surgery 5 days after arrival |
| Small animal ear tags | National Band and Tag co | 1005-1 | |
| Sterile surgical drapes | Braintree Scientific | SP-MPS | |
| Synergy 2 plate reader | BioTek | n/a | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | harmful to human health |
| Virapower lentiviral packaging mix | Life Technologies | K4975-00 | |
| Xfect Transfection reagent | Clontech | 631318 | |
| Xylazine | Valley Vet | 468RX |
Referencias
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