Bestuderen van microbiële gemeenschappen<em> In Vivo</em>: Een model van de Host-gemedieerde interactie tussen<em> Candida albicans</em> En<em> Pseudomonas aeruginosa</em> In het Airways
Summary
While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.
Abstract
Bestuderen van gastheer-pathogeen interactie stelt ons in staat om de onderliggende mechanismen van de pathogeniciteit te begrijpen tijdens de microbiële besmetting. De prognose van de gastheer is afhankelijk van de betrokkenheid van een aangepaste immuunreactie tegen de pathogeen 1. Immuunrespons is complex en de resultaten van de interactie van verschillende pathogenen en immune of niet-immune celtypes 2. In vitro studies kunnen deze interacties te karakteriseren en gericht op mobiele-pathogeen interacties. Bovendien is in de luchtweg 3, vooral bij patiënten met etterige chronische longziekte of kunstmatig beademde patiënten, polymicrobiële gemeenschappen aanwezig compliceren gastheer-pathogeen interactie. Pseudomonas aeruginosa es Candida albicans beide problemen pathogenen 4 vaak geïsoleerd uit tracheobronchiale monsters, en geassocieerd met ernstige infecties, vooral in intensive care unit 5. Microbiële interactiesgerapporteerd tussen deze pathogenen in vitro maar de klinische gevolgen van deze interacties onduidelijk 6. Om de interacties tussen C. Albicans es P. bestuderen aeruginosa, een muizenmodel van C. albicans luchtwegen kolonisatie, gevolgd door P. aeruginosa- gemedieerde acute longinfectie werd uitgevoerd.
Introduction
Diermodellen, in het bijzonder muizen, zijn uitgebreid gebruikt om immuunresponsen tegen ziekteverwekkers te ontdekken. Hoewel aangeboren en verworven immuniteit verschillen tussen knaagdieren en mensen 7, het gemak in kweek en de ontwikkeling van knockouts voor tal van genen maakt muizen een uitstekend model om immune responsen 8 bestuderen. De immuunrespons is complex en voortvloeit uit de wisselwerking van een pathogeen, de bewoner microbiële flora en verschillende immune (lymfocyten, neutrofielen, macrofagen) en niet-immune (epitheelcellen, endotheelcellen) celtypes 2. In vitro studies niet toestaan observeren deze complexe interacties en zich vooral richten op unieke cel-pathogeen interacties. Terwijl diermodellen moet met voorzichtigheid worden gebruikt en beperkt tot zeer specifieke en relevante vragen, muis modellen geven een goed inzicht in het zoogdier immuunrespons in vivo en kunnen delen van belangrijke klinische 7 vragen aan te pakken.
<p class="jove_content"> In de luchtwegen, de microbiële gemeenschap complex associëren van een groot aantal verschillende micro-organismen 6. Terwijl wat een "normale" luchtwegen microbiome moet nog worden bepaald, inwoner gemeenschappen vaak polymicrobiële, en afkomstig van verschillende ecologische bronnen. Patiënten met een etterige chronische longziekte (cystic fibrosis, bronchectasis) of mechanisch geventileerde patiënten vertonen een bijzondere flora vanwege kolonisatie van de luchtwegen door milieuvriendelijke verworven micro-organismen 9. Pseudomonas aeruginosa es Candida albicans zijn beide probleem pathogenen 5, vaak samen geïsoleerd van tracheobronchiale monsters en verantwoordelijk voor ernstige opportunistische infectie bij deze patiënten, vooral in de intensive care unit (ICU) 4.Isolatie van deze micro-organismen tijdens acute longontsteking bij ICU resulteert in anti-microbiële behandeling tegen P. aeruginosa but gist worden gewoonlijk niet beschouwd als pathogeen op deze plaats 5. In vitro interactie tussen P. aeruginosa es C. albicans zijn op grote schaal gemeld en toonde dat deze micro-organismen groei en overleving van elkaar kunnen beïnvloeden maar studies konden concluderen of de aanwezigheid van C. albicans schadelijk hetzij gunstig voor de host 10. Muismodellen zijn ontwikkeld om dit relevant P. pakken aeruginosa es C. albicans in vivo, maar de interactie tussen micro-organismen niet het belangrijkste punt. Inderdaad, werd het model opgericht om de betrokkenheid van C. evalueren albicans in gastheer immuunrespons, en het resultaat.
Een vorige model opgericht door Roux et al reeds een eerste kolonisatie met C. albicans gevolgd door een acute longinfectie veroorzaakt door P. aeruginosa. Met behulp van hun model, vonden de auteurs een schadelijke rol van prior C. albicans kolonisatie 11. Echter Roux et al gebruikten een hoge belasting van C. albicans in hun uitvoering met 2 x 10 6 CFU / muis gedurende 3 opeenvolgende dagen. We een 4-daagse model van C. albicans luchtwegkolonisatie, althans persistentie zonder longbeschadiging, In dit model C. albicans werd teruggewonnen tot 4 dagen na een enkele indruppeling van 10 5 CFU per muis (Figuur 2B) 12,13. Na 4 dagen werd geen bewijs van inflammatoire cel werving, inflammatoire cytokine productie noch epitheelbeschadiging waargenomen. Op 24 – 48 uur, op het hoogtepunt aanwezigheid van C. albicans, terwijl een cellulaire en cytokine aangeboren immuunrespons waargenomen, was er geen bewijs van longbeschadiging. Verrassenderwijs muizen aldus gekoloniseerd met C. albicans 48 uur voorafgaand aan de instillatie van P. intranasale aeruginosa infectie was verzwakt in vergelijking met muizen met P. aeruginosa infecties alleen. ikndeed, muizen vertoonden minder longbeschadiging en verminderde bacteriële last 12,13.
Verschillende hypotheses kan dit gunstige effect van voorafgaande kolonisatie met C. verklaren albicans op P. aeruginosa gemedieerde acute longinfectie. Ten eerste, een interspecies overspraak waarbij elk micro-quorum sensing systemen, de homoserinelactone gebaseerde P. aeruginosa systeem en de Farnesol gebaseerde C. albicans systeem geëvalueerd. Ten tweede, C. albicans als een "decoy" target voor P. aeruginosa omleiden van het pathogeen uit longepitheelcellen bestudeerd. Beide hypothesen werden ongeldig (ongepubliceerde gegevens). De derde hypothese was dat van een "priming" van het aangeboren immuunsysteem door C. albicans verantwoordelijk voor een versterkte volgende aangeboren respons tegen P. aeruginosa. Deze laatste hypothese werd bevestigd. Inderdaad C. albicans kolonisatie leidde tot een priming van aangeboren immuniteit through IL-22, voornamelijk uitgescheiden door aangeboren lymfoïde cellen, wat resulteert in verhoogde bacteriële verwijdering en verminderde longbeschadiging 12.
Concluderend is de gastheer een centrale actor in de interactie tussen microorganismen moduleren van de aangeboren immuunrespons en waarbij verschillende inflammatoire celtypen. Hoewel deze complexe immuuninteracties kan worden ontleed in vitro de oorspronkelijke hypothesen alleen nodig, worden voorzien in vivo modellen. Het volgende protocol geeft een voorbeeld van in vivo onderzoek van gastheer pathogeen gemedieerde interacties die kunnen worden aangepast voor andere micro-organismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diermodellen, in het bijzonder zoogdieren, bruikbaar complexe mechanismen van gastheer-pathogeen interactie helderen op het gebied van immuniteit. Natuurlijk, de behoefte aan informatie verkregen uitsluitend uit dierlijke modellen moeten onontbeerlijk zijn; Anders moet gebruik van dieren worden vervangen door in vitro modellen. Dit diermodel illustreert het inzicht dat alleen kan worden verschaft door een diermodel aangezien de interactie tussen pathogenen wordt gemedieerd door een multi-component gastheerrespo…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the University of Lille and the Pasteur Institute of Lille, especially Thierry Chassat and Jean-Pierre Decavel, responsible for animal housing breeding safety and husbandry. This work was supported by the “Société de Pathologies Infectieuses de Langue Française” (SPILF).
Materials
| Sevorane, Sevoflurane | Abott | 05458-02 | 250 mL plastic bottle |
| Fluorescence Reader Mithras LB940 | Berthold Technologies | reference in first column | no comment |
| Bromo-cresol purple agar | Biomerieux | 43021 | x20 per unit |
| Pentobarbital sodique 5,47% | CEVA | 6742145 | 100 mL plastic bottle |
| 2-headed valve | Distrimed | 92831 | no comment |
| Sterile inoculation loop 10 µL | Dutscher | 10175 | x1000 conditioning |
| Insuline syringes 1 mL | Dutscher | 30003 | per 100 conditioning |
| 2 positions Culture tube 8 mL | Dutscher | 64300 | no comment |
| Ultrospec 10 | General Electric life sciences | 80-2116-30 | no comment |
| Hemolysis tubes 13 x 75 mm | Gosselin | W1773X | per 100 |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | Life technologies | 10010023 | packaged in 500 mL |
| amikacin 1g | Mylan | 62516778 | per 10 |
| Heparin 10 000 UI in 2 mL | Pan pharma | 9128701 | x 10 per unit |
| RAL 555 coloration kit | RAL Diagnostics | 361550 | 3 flacons of 100 mL |
| 1,5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 55.526.006 | x 1000 |
| Transparent 300 µL 96-well plate | Sarstedt | 82 1581500 | no comment |
| Yest-peptone-Dextrose Broth | Sigma | 95763 | in powder |
| FITC-albumin | Sigma | A9771 | in powder |
| Luria Bertani Broth | Sigma | L3022 | in powder |
| 25-gauge needle | Terumo or unisharp | A231 | x100 conditioning |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | no comment |
Referencias
- Casadevall, A., Pirofski, L. -. A. The damage-response framework of microbial pathogenesis. Nat. Rev. Micro. 1 (1), 17-24 (2003).
- Eddens, T., Kolls, J. K. Host defenses against bacterial lower respiratory tract infection. Curr. Opi. Immunol. , (2012).
- Beck, J. M., Young, V. B., Huffnagle, G. B. The microbiome of the lung. Translational research : J. Lab. Clin Med. 160 (4), 258-266 (2012).
- Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).
- Nseir, S., Ader, F. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans: do they really need to stick together. Crit. Care Med. 37 (3), 1164-1166 (2009).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat. Rev. Micro. 8 (1), 15-25 (2010).
- Gibbons, D. L., Spencer, J. Mouse and human intestinal immunity: same ballpark, different players; different rules, same score. Mucosal Immunol. 4 (2), 148-157 (2011).
- Ariffin, J. K., Sweet, M. J. Differences in the repertoire, regulation and function of Toll-like Receptors and inflammasome-forming Nod-like Receptors between human and mouse. Curr. Opi. Micro.. , (2013).
- Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. Ventilator-Induced Lung Injury. NEJM. 369 (22), 2126-2136 (2013).
- Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).
- Roux, D., Gaudry, S., et al. Candida albicans impairs macrophage function and facilitates Pseudomonas aeruginosa pneumonia in rat. Crit. Care Med. 37 (3), 1062-1067 (2009).
- Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect. Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
- Ader, F. Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa load and lung injury in a mouse model. Crit. care. , 1-33 (2009).
- Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).
- Stover, C. K., Pham, X. Q., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).
- Boutoille, D., Marechal, X., Pichenot, M., Chemani, C., Guery, B. P., Faure, K. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp. Lung Res. 35 (4), 263-271 (2009).
- Faure, E., Mear, J. -. B., et al. Pseudomonas aeruginosa type-3 secretion system dampens host defense by exploiting the NLRC4-coupled inflammasome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (7), 799-811 (2014).
- Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).
