Экстракорпоральное модели физиологических и патологических кровотока с применением к расследованиям клеток сосудов Ремоделирование
Summary
Этот протокол повторяет физиологическим или патологическим поток крови в пробирке, чтобы помочь в определении клеточного ответа в патологии заболевания. Вводя давление демпфирования камеру вниз по течению от насоса крови, кровоток через сосудистую может быть наложен воспроизводятся и на монослой эндотелия сосудов или миметического совместного культивирования.
Abstract
Сосудистые заболевания является частой причиной смерти в Соединенных Штатах. Здесь мы представляем метод для изучения вклада динамики потока к патологии сосудистого заболевания. Нездоровые артерии часто присутствует с настенным жесткости, рубцов, стеноза или частичное, которые могут повлиять на все скорости потока жидкости, и величина пульсирующего потока, или индексом пульсации. Репликация различных условий потока является результатом настройки давления потока демпфирующей камере ниже по потоку от насоса крови. Введение воздуха в системе замкнутого потока позволяет сжимаемой среды поглощать ударные давление от насоса, и, следовательно, изменяются индекс пульсации. Описываемый способ просто воспроизводить, с высоко контролируемого ввода и легко измеримых результатов. Некоторые ограничения воссоздание комплекса физиологической формы импульса, который только приближенно системой. Эндотелиальные клетки, клетки гладких мышц и фибробласты страдают от Thr кровотокаух артерию. Динамический компонент кровотока определяется выходной и артериальной стенки соответствии сердечной. Сосудистая клеток механо-трансдукции динамики потоков может вызвать высвобождение цитокинов и перекрестные помехи между типами клеток внутри артерии. Совместное культивирование клеток сосудов является более точная картина отражает взаимодействие клетка-клетка на стенки кровеносных сосудов и сосудов ответ на механическое сигнализации. Вклад динамики потоков, в том числе клеточного ответа на динамических и средних (или стационарных) компонентов потока, поэтому важным показателем в определении патологии заболевания и эффективность лечения. Путем внедрения в пробирке модель совместного культивирования и давление демпфирования ниже насоса крови, которая производит имитацию сердечного выброса, различные патологии артериальной болезни могут быть исследованы.
Introduction
Заболеваемость сердечно-сосудистых заболеваний являются крупнейшим в Америке, многие в результате нездорового сосудов. Здоровые артерии состоят из эластичной ткани, с мягкой поверхности просвета покрытого эндотелиальных клеток (EC) монослоя. Артериальная потока может быть смоделирована как колебательной волновой функции с положительной средней скорости потока. Индекс пульсации (PI) является фактором колебаний величины и среднего потока (PI = (Макс. – Мин.) / Среднее), 1 и был смоделирован в пробирке с переменной эластичностью сосудов 2 эластичности артерий является важным хранения потока. энергия сердечных сокращений, расширяя при систолического давления, и играет важную роль в модуляции кровотока PI. Потому что сердце поддерживает последовательную, пульсирующее, объемный поток, артериальная расширение увеличивает площадь поперечного сечения, укрепления стабильности потока за счет снижения скорости потока, напряжение сдвига, и PI. Часто, нездоровые артерии представляют изменения эластичностиили соответствие, отображение жесткости из сосудистого ремоделирования, рубцовой ткани или кальцификации 3, 4. Кроме того, другие сосудистые расстройства, такие как гиперплазии неоинтимы (NIH), 5 аневризмы и гипертонии 6 и сосудистой фиброза 4, может сжиматься диаметр сосуда. Тем не менее, текущее лечение наркомании и лечение устройство сосудистых заболеваний часто пренебрегают важность соблюдения динамики стенки сосуда или кровотока в сосудистой болезни, которая часто осложняется изменениями в морфологии сосуда и свойств. Ни баллонная ангиопластика, ни стентирование ответить на усложнение стены эластичности 7. Таким образом, моделирование в пробирке кровь течет в результате заболеваний артерий и лечения имеет важное значение в расследовании патологий болезни и будущей эффективности лечения. Здесь мы опишем метод тиражирования физиологических и патологических кровоток, предназначенный для определения реакции клеток в Pathol сосудистых заболеванийгиях. Поток жидкости вызывает напряжение сдвига на стенке сосуда, что является важным механический сигнал в здоровье сосудов, влияет на все клетки в сосудистой. Несколько механические датчики на эндотелий сосудов для жидкости сдвига были определены, в том числе первичной реснички, показанной в последних исследованиях для эндотелия mechanosensing 8. Эндотелиальная активность клеток и морфология влияют на скорость потока, направление и пульсации. Кроме того, клетки гладкой мышцы (SMC) миграция может быть затронуты механо-сигналов низкого скорости потока через интерстициальной жидкости 9, а также может быть через паракринной сигнализации от эндотелиальных клеток через их ответ на поток и механо-трансдукции сигналов расхода с помощью цитокина освободить 10. К "доза" зависимость среднего сдвига, PI, и паракринной сигнализации может быть взаимозависимы. Для этого, определение реакции клеток сосудов к сдвигу жидкости с различной дозировки "" в монослоя культурыили совместное культивирование в пробирке может обеспечить механистические идеи в ремоделирования сосудов и улучшить болезни и прогноз лечения. Система подачи в этом эксперименте использовали состоит из насоса крови, выше по течению потока в воздушном резервуаре демпфирования, ниже по потоку расходомера только во время экспериментальной установки, расположенный ниже по потоку культуры клеток, проточную камеру с параллельными пластинами, и средства массовой информации резервуара. Контроль переменных сосудистых потока, такие как средняя скорость потока, ударов в минуту, и ПИ может быть достигнуто путем контроля расхода, частоты пульса, и внедрение давления демпфирования. Пульсирующие насосы крови доступны со смещением переменной инсульта, при контролируемой частоты хода, относящиеся непосредственно к виду объемный расход и частоту пульса. Введение воздушный резервуар внутри контура потока позволяет демпфирования давления, уменьшая величину колебаний потока. Медиа несжимаемой жидкости, в то время как воздух внутри камеры затухания является сжимаемым, что позволяет избыточное давление от волны потока будетпоглощается сжатия воздуха. Воздух соотношение СМИ позволяет за контроль над, как происходит большое демпфирование. Пользовательский культуры клеток проточная камера 75 мм в длину на 50 мм в ширину была создана из акрила. Поток входит через входное отверстие, и расширяет через впускной коллектор, обеспечивающий равномерную подачу по всей полноте проточную камеру. Похожие потока и структуры присутствуют на выходе камеры. Клетки высевают на функционализированных слайды, а затем прикрепляется к проточной камере. Это позволяет для больших групп населения, легко вызываются после исследования. Сотрудничество культуры эксперименты могут использовать пористую мембрану из поликарбоната для устранения клетки к клетке контакт между культурами, позволяя транспорт цитокинов / потока. Эта система была ранее использована для моделирования высокого пи поток и его влияние на эндотелиальную культуры монослоя и EC / SMC сокультуре 1, 10, исследовать реакцию клеток на патологически высокой заболевания ПИ. Описывая протокол, используемый для моделирования этих кон потокаусловиях, мы надеемся помочь другим в определении вклада сигнала потока на мобильные ответ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описан способ воспроизведения потока пульсирующего в пробирке, и может играть важную роль первый шаг в определении вклада условий потока в патологии болезни. Предыдущие исследования, использующие этот протокол нашли условия потока способствуют сосудистой воспали?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность источников финансирования, в том числе AHA (13GRNT16990019 для WT) и NHLBI (HL097246 и HL119371 к WT).
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)trethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70mm x 50mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/mL) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
Referencias
- Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- Tan, Y., et al. Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-κB Pathway. PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).
- Wexler, L., et al. Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association. Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).
- Lan, T. -. H., Huang, X. -. Q., Tan, H. -. M. Vascular fibrosis in atherosclerosis. Cardiovasc Pathol. 22 (5), 401-407 (2013).
- Lee, C. H., et al. Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents. Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis. Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).
- Greil, O., et al. Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry. J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).
- Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function. Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).
- Liu, S. Q., Goldman, J. Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration. IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).
- Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression. AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).
- Panaritis, V., et al. Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients.. Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).
- Miao, H., et al. Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations. J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).
