Generación de Genéticamente Modificados cultivos de piel organotípicos Uso Desvitalizada Dermis Humana
Summary
The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.
Abstract
Los cultivos organotípicos permiten la reconstitución de un entorno 3D crítico para contacto célula-célula y célula-matriz interacciones que imita la función y la fisiología de sus homólogos de tejidos in vivo. Esto se ejemplifica con cultivos de piel organotípicos que recapitula fielmente la diferenciación epidérmica y el programa de la estratificación. Queratinocitos epidérmicos humanos primarios son genéticamente manipulable mediante retrovirus donde los genes pueden ser fácilmente sobreexpresan o derribados. Estos queratinocitos modificados genéticamente se pueden utilizar para regenerar la epidermis humana en cultivos de piel organotípicos proporcionan un poderoso modelo para estudiar vías genéticas de crecimiento epidérmico de impacto, la diferenciación y la progresión de la enfermedad. Los protocolos presentados aquí describen métodos para preparar dermis humana desvitalizados, así como para manipular genéticamente los queratinocitos humanos primarios a fin de generar cultivos de piel organotípicos. La piel humana regenerada se puede utilizar en downstream aplicaciones tales como perfiles de expresión génica, la inmunotinción y inmunoprecipitaciones cromatina seguido de secuenciación de alto rendimiento. Por lo tanto, la generación de estos cultivos de piel organotípicos modificados genéticamente permitirá la determinación de los genes que son críticos para el mantenimiento de la homeostasis de la piel.
Introduction
La epidermis humana es un epitelio estratificado que se conecta a la dermis subyacente a través de una matriz extracelular conocida como la epidermis terraza, plancha membrana basal no sólo sirve como una barrera impermeable para evitar la pérdida de humedad, sino también como una primera línea de defensa para proteger la cuerpo de sustancias extrañas y tóxicos 1. La capa basal, que es la capa más profunda de la epidermis, contiene las células madre epidérmicas y progenitoras que dan lugar a la progenie diferenciada que forman el resto de la epidermis 2. Como las células progenitoras se diferencian epidérmicas que migran hacia arriba para formar la primera capa de células diferenciadas conocida como la capa espinosa 3. En la capa espinosa, las células se convierten en la expresión de las queratinas 1 y 10, que a continuación proporciona la fuerza para soportar el estrés físico para las capas diferenciadas de la epidermis. Como las células de la capa espinosas diferenciar aún más, se mueven hacia arriba en la epidermis a FORm la capa granular, que se caracteriza por la formación de gránulos de queratohialina y laminares, así como proteínas estructurales que se ensamblan por debajo de la membrana plasmática. Como las células proceden en el proceso de diferenciación, las proteínas por debajo de la membrana plasmática son cruz vinculadas entre sí, mientras que los gránulos lamelares son extruidos a partir de las células para formar un lípido barrera rica llama el estrato córneo 4.
Enfermedades que implican alteraciones en crecimiento epidérmico y el impacto diferenciación ~ 20% de la población 5. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos de este proceso es de gran importancia. Desde manifestación de muchas de estas enfermedades está supeditada a la célula-célula o célula-matriz de contacto, cultivos organotípicos donde la epidermis humana se reconstituye en un entorno 3D se han creado 6-10. Estos métodos implican típicamente el uso de queratinocitos primarios o transformadas sembradas sobre la matriz extracelular tales como humano desvitalizadodermis, Matrigel, o colágeno.
Para entender los mecanismos de regulación de genes que son importantes en crecimiento epidérmico y la diferenciación, los queratinocitos se pueden manipular genéticamente a través de vectores retrovirales para derribar o sobreexpresar genes en cultivo 2D y luego reconstituirse en 3D. Estos métodos se han utilizado ampliamente para caracterizar genes implicados en la madre epidérmicas y células progenitoras auto-renovación y diferenciación, así como la progresión a neoplasia 11-21. Aquí, se proporciona un protocolo en profundidad sobre cómo alterar la expresión de genes en cultivos organotípicos epidérmicas a través del uso de los retrovirus.
Protocol
Representative Results
Discussion
La manipulación genética en la piel humana cultivos organotípicos ofrecen muchas ventajas para estudió comúnmente 2D células cultivadas, así como modelos de ratón. Culturas 2D carecen de las tres interacciones célula-matriz celular y extracelular de las células dimensionales que se encuentran en tejidos y órganos intactos. Estudios recientes también han encontrado enormes diferencias entre las células de cáncer de piel cultivadas en 2D y 3D con las células cultivadas en 3D que muestran mucho más similitu…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue supportedby la Sociedad Americana del Cáncer de Investigación estudiosos Grant (RSG-12-148-01-DDC) y el Premio de Biología CIRM Básica (RB4-05779).
Materials
| Human skin | New York Firefighters Skin Bank | http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html |
| PEN/STREP | GIBCO | 15140-122 |
| amphotropic phoenix cell lines | ATCC | CRL-3213 |
| FUGENE 6 transfection reagent | Promega | E2691 |
| Keratinocyte Media (KCSFM) | Life Technologies | 17005042 |
| DMEM | GIBCO | 11995 |
| Ham's F12 | Cambrex | 12-615F |
| FBS | GIBCO | 10437-028 |
| Adenine | Sigma | A-9795 |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 |
| Hydrocortisone | Calbiochem | 3896 |
| Insulin | Sigma | I-1882 |
| EGF | Invitrogen | 13247-051 |
| Transferrin | Sigma | T-0665 |
| Ciprofloxacin Hydrochloride | Serologicals | 89-001-1 |
| cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 |
| Matrigel | Corning | 354234 |
| Keratin 1 antibody | Biolegend | PRB-149P |
| square pegs | Arts and crafts stores | |
| human neonatal keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 |
| human neonatal keratinocytes | Cell Applications | 102K-05n |
| MSCV retroviral vector | Clontech | 634401 |
| LZRS retroviral vector | Addgene | |
| pSuper.Retro.Puro Retroviral vector | Oligoengine | VEC-PRT-0002 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268-5G |
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