Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.
أهداف الطريقة الموصوفة لتحليل تركيز الكورتيزون في البراز الخيول من أجل توفير تقييم غير الغازية للنشاط الغدة الكظرية. قياس النشاط (HPA) محور الغدة النخامية، الغدة الكظرية هو نهج قبولهم للدراسة الاستجابة لحالات يحتمل أن تكون مكره في كل من الأنواع في الأسر والمحلية. تقنية الإشارة وطريقة الأكثر استخداما هو استخدام بلازما الدم 1 ومع ذلك، الطرق البديلة مثل تحليل البراز وضعت من أجل التغلب على الإجهاد الناجم عن اخذ عينات من الدم نفسها والسماح القدرة على رصد الأنواع الطليقة.
أثناء وضع مكره، تعطل التوازن الفيزيولوجي. منطقة ما تحت المهاد في الدماغ النشرات المنمية القشرية الافراج عن هرمون (CRH) الذي يعمل على الغدة النخامية الأمامية ويحفز الافراج عن الهرمون الموجه لقشر الكظر (ACTH). ACTH يدخل مجرى الدم، ويحفز قشرة الغدة الكظرية لإفراز مسكوكةق السكرية محددة (GC). ترتبط ارتباطا وثيقا السكرية الأحداث المجهدة بدلا من أن تنتج باستمرار في جميع ولايات الطاقة المتزايدة ولذا غالبا ما يتم قياسها في تفضيل اكثر من غيرها من الإجهاد ترتبط الهرمونات 2. السكرية هي المسؤولة عن العديد من الآثار التكيف في الخيول. وحشدت الطاقة بسرعة من مواقع التخزين في الجسم في شكل من الأحماض الدهنية والجلوكوز، وزيادة كمية الأوكسجين، مما يعزز وظيفة حسية (3) وانخفاض تدفق الدم الى مناطق غير الضرورية لحركة 4. وكذلك بوصفها آلية التعامل، وارتفاع التوتر الناجم في السكرية قد يساعد أيضا على إعداد الحيوان للالضغوطات المقبل 5.
تقييم مستويات الهرمون في البلازما واللعاب ينطوي على قياس هرمون تعميم الفعلي ومع ذلك، وقياس نواتج الأيض في التدابير البراز المنتج النهائي التمثيل الغذائي للهرمون. وcatabolized المنشطات المتداولة في لترإيفر قبل الإفراز في لالصفراء حيث أنها تخضع لتغييرات أخرى بتسهيل من الأنشطة الإنزيمية من النباتات البكتيرية داخل مسار الأمعاء 6. لذلك، المناعية الموجهة نحو السكرية في الدم قد لا تكون مناسبة لتحليل نواتج الأيض جلايكورتيكود البرازية 7.
كما يمكن أن يتم جمع البراز من دون أي إزعاج للحصان، وتحليل البراز للكورتيزون، وقد استخدم على نطاق واسع لمراقبة نشاط HPA في عدد من الظروف. تم الإبلاغ عن كورتيزون ارتفاع في البراز من الخيول استجابة لحالات يحتمل أن تكون مكره بما في ذلك أثناء العلاج البيطري بعد العملية 8 وفي السكن تقييدا 9. تعكس أخذ العينات البرازية مستوى جلايكورتيكود المجمعة مع مرور الوقت بدلا من نقطة في أخذ العينات في الوقت التي تقدمها البلازما واللعاب مما يجعله مناسبا لرصد المدى الطويل المزمن أو الأنماط الموسمية 10. ويرجع ذلك إلى غير الغازيةطبيعة الأسلوب، والعينات ويمكن جمع مرارا وتكرارا للفرد دون الحاجة إلى التقاط أو ضبط النفس 11. ومع ذلك، يجب أن تؤخذ أنواع محددة وقت عبور القناة الهضمية في الاعتبار عند التخطيط لبروتوكول أخذ العينات. في الخيول، والوقت الأمعاء عبور حوالي 18 ساعة 12 وبالتالي، يمكن الكشف عن استجابة الغدة الكظرية والأيض كورتيزون لاحقة في البراز بعد يوم واحد تفعيل الأولي للمحور HPA.
عندما تستخدم تقنيات المناعية غير الغازية التحقق من صحة دقيق لهذه الأنواع يجري التحقيق ضروري 13. وبالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن الفروق بين الجنسين في هرمون الأيض إفراز ربما بسبب الاختلافات في معدل الأيض ونوع الأيض كورتيزون تفرز في مختلف الأنواع بما في ذلك الفئران 14، والدجاج (15). ولذلك كان من المهم كجزء من هذا الأسلوب الذي تم التحقق من صحة فحص للاستخدام في كل من الذكور والإناث الخيول المحلية كما هو مفصل في البروتوكول البريد. هذا الاختلاف في عملية الأيض الهرموني بين الجنسين له عواقب على نوعية البيانات إلا أنه نادرا ما يتم معالجتها وتضمينها كجزء من التحقق من صحة الفحص.
وتسمح هذه الطريقة غير الغازية تقييم المدى الطويل من النشاط الغدة الكظرية في الخيول المحلية. تفاصيل البروتوكول كل من المصادقة على فحص وتقنية فحص نفسها.
يوفر تحليل البراز كورتيزون وسيلة لتقييم أنماط طويلة المدى لنشاط الغدة الكظرية في الخيول. طبيعة غير الغازية من طريقة تتغلب على آثار الخلط من طرق أخذ العينات الأخرى المستخدمة لتقييم نشاط الغدة الكظرية بما في ذلك اللعاب والبلازما تحليل 9. وبالإضافة إلى ذلك الأسلو…
The authors have nothing to disclose.
Funding for the production of this manuscript was provided by Nottingham Trent University. The authors wish to thank the University yard manager, Anna Gregory for the use of her horses and provision of fecal samples for use in the protocol. Thanks also to Chester Zoo Wildlife Endocrinology Laboratory for use of their facilities.
Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
Buffer capsules – pH 4 | VWR | 332732B | |
Buffer capsules – pH 7 | VWR | 332742D | |
Buffer capsules – pH 10 | VWR | 332762H | |
Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
Air compressor | |||
Centrifuge | |||
Computer +printer | |||
fridge-freezer | |||
Drying apparatus | |||
+tubing | |||
Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
Fume cupboard | |||
Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
Microplate reader | VWR | ||
Microplate washer | VWR | ||
pH meter | VWR | ||
Eppendorf Research® pipettes – multipack option 2 | VWR | ||
Pipette – 1000ul | VWR | ||
Pipette – 200ul | VWR | ||
Pipette – 20ul | VWR | ||
Repeater pipette | VWR | ||
Pipette filler | VWR | ||
Orbital shaker | Progen Scientific | ||
Sonicator | Hilsonic | ||
Vortex | VWR | ||
Warm water bath | |||
Water purification system | Millipore |