La eliminación selectiva de células de Cultura mezclada 3D mediante técnica de infrarrojo cercano Photoimmunotherapy

Summary

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Abstract

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Introduction

La eliminación de células específicas sin dañar otras células es extremadamente difícil, especialmente en el tejido establecido, y hay una necesidad urgente de un método de eliminación de células en el campo de la ingeniería de tejidos. Hoy en día en el campo de la medicina regenerativa, cultivos de tejidos utilizando células madre embrionarias (ES), células madre pluripotentes (PSCs), o célula madre pluripotente inducida (iPS) son materiales prometedores ^{de 1 – 3.}

Aunque esta regeneración de tejidos es prometedor, la contaminación con células no deseadas es una preocupación importante. Por otra parte, hay un problema de seguridad de la tumorigenicidad después del trasplante ^4,5. Aunque muchos estudios se han centrado en estos temas para eliminar células específicas, sobre todo en la medicina regenerativa ^6-8, ningún método práctico se ha desarrollado.

photoimmunotherapy infrarrojo cercano (NIR-PIT) es un tratamiento basado en un anticuerpo conjugat-fotoabsorbentee (APC). Una APC consiste en un anticuerpo específico de células monoclonal (mAb) y un fotoabsorbente, IR700. IR700 es un derivado de sílice-ftalocianina hidrofílica y no induce por sí mismo fototoxicidad ^9. IR700 está conjugado covalentemente al anticuerpo a través de los residuos de amida en la cadena lateral de moléculas de lisina. La APC se une moléculas diana en la membrana celular y luego se provoca necrosis celular casi inmediata después de la exposición a la luz NIR a 690 nm. Durante la exposición a la luz NIR, se rompe la membrana celular que conduce a la muerte ^{de 9} celdas ^{– 14.} NIR-PIT ha demostrado ser eficaz con múltiples anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, incluyendo anti-EGFR, anti-HER2, anti-PSMA, anti-CD25, anti-mesotelina, anti-GPC3, y anti-CEA ^15-21. Por lo tanto, NIR-PIT se puede utilizar contra una amplia variedad de moléculas diana. Por otra parte, NIR-PIT es un tratamiento bien controlado que permite el tratamiento selectivo de regiones específicas mediante la restricción de la NIR-light irradiación ^18,22.

A continuación, presentamos un método de eliminación de células específicas mediante NIR-PIT 3D a partir de cultivos mixtos.

Protocol

Nota: El siguiente protocolo describe los pasos necesarios para eliminar las células específicas utilizando NIR-PIT. Controles y otros detalles acerca de NIR-PIT y la viabilidad celular se pueden encontrar en otro lugar 18. 1. Conjugación del IR700 a anticuerpos monoclonales (mAb) Preparar mAb de interés a 2-5 mg / ml en solución (pH 8,6) 0,1 M Na 2 HPO 4. Mezclar 6,8 nmol de mAb con 30,8 nmol de IR700 10 mM en M Na 2 HPO 4 solució…

Representative Results

Para monitorizar ópticamente el efecto de NIR-PIT, la línea celular A431, que sobreexpresa el EGFR, fue modificado genéticamente para expresar también GFP y luciferasa (luc-A431-GFP). Como que no son objeto de NIR-PIT, la línea de células Balb / 3T3 se modificó para expresar ópticamente RFP (3T3-RFP). La APC, panitumumab-IR700 (pan-IR700), se sintetizó. Esferoides mixtos, que se componen de diversas relaciones de células (A431-luc-GFP y 3T3-RFP) se fabricaron de acuerdo con est…

Discussion

Se demuestra un método de eliminación de células específica de un cultivo celular mixto 3D sin daño a las células no diana mediante el uso de NIR-PIT. Hasta ahora, no hay ningún método práctico de eliminación de células una vez establecido el tejido o después del trasplante. Por lo tanto, NIR-PIT es un método prometedor para lograr esto. Esta técnica podría utilizarse también in vivo ^18,22, ya que las CPA muestran una farmacocinética similar a sí mismo mAb. El tipo…

Materials

IRDye 700DX Ester Infrared Dye	LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)	929-70011
Na2HPO4	SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)	S9763
Sephadex G25 column (PD-10)	GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)	17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay	Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)	PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates	3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA)	HDP1096-8
Optical power meter	Thorlabs (Newton, NJ, USA)	PM100
LED: L690-66-60	Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA)	L690-66-60
Vectibix (panitumumab)	Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35mm glass bottom dish, dish size 35mm, well size 10mm	Cellvis (Mountain View, CA, USA)	D35-10-0-N