Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões
Summary
Este protocolo apresenta um método para realizar, de uma única célula quantitativa análise in situ da expressão de proteínas para o estudo especificação das linhagens em embriões de rato pré-implantação. Os procedimentos necessários para a coleta de blastocistos, toda montagem de detecção de imunofluorescência de proteínas, a imagem latente de amostras em um microscópio confocal, e segmentação nuclear e análise de imagem são descritos.
Abstract
Este protocolo apresenta um método quantitativo para executar, de uma única célula in situ análises de expressão de proteínas para o estudo especificação linhagem em embriões pré-implantação do mouse. Os procedimentos necessários para a coleta de embriões, imunofluorescência, a imagem latente em um microscópio confocal, e segmentação de imagens e análise são descritos. Este método permite a quantificação da expressão de vários marcadores nucleares e a espacial (XYZ) coordenadas de todas as células no embrião. Ela tira proveito de MINS, uma ferramenta de software segmentação de imagens desenvolvido especificamente para a análise de imagens confocal de embriões pré-implantação e colônias de células-tronco embrionárias (ESC). MINS realiza segmentação nuclear sem supervisão entre o X, Y e Z dimensões, que produz uma informação sobre a posição da célula no espaço tridimensional, bem como os níveis de fluorescência nuclear para todos os canais de entrada do utilizador com o mínimo. Embora este protocolo foi optimizado para a análise de imagensde pré-implantação de embriões fase de ratinho, que pode ser facilmente adaptado para a análise de quaisquer outras amostras que apresentam uma boa relação sinal-ruído e onde a densidade nuclear elevada coloca um obstáculo para a segmentação de imagens (por ex., análise de células estaminais embrionárias expressão (ESC ) colônias, células em cultura, embriões de outras espécies ou estágios, etc.) de diferenciação.
Introduction
O embrião de rato pré-implantação é um paradigma para estudar a formação e a manutenção da pluripotência in vivo, bem como um modelo para o estudo da especificação destino celular e epitelização de novo em mamíferos. Os estágios pré-implantação de desenvolvimento dos mamíferos são dedicados à criação das três linhagens de células que compõem o blastocisto, ou seja, o epiblasto pluripotentes – que dá origem à maioria dos tecidos somáticos e células germinativas – e duas linhagens extraembryonic, o trofectoderma (TE) ea endoderme primitiva (PRE) (Figura 1A) 1,2. Este protocolo descreve os procedimentos para (1) embriões colheita e corrigir estágio de pré-implantação do rato, (2) realizar imunofluorescência para identificar proteínas de interesse, (3) realizar todo-montagem de imagens usando um microscópio confocal com capacidades de seccionamento z e (4) realizar segmentação nuclear de imagens confocal e análises subsequentes imagem quantitativa. Este gasoduto permite tele imparciais medição dos níveis de proteína para a atribuição de identidades celulares para caracterizar subpopulações de células in situ. Este protocolo pode ser levada a cabo em tão pouco quanto 3-4 dias para um único ninhada (geralmente até 10 embriões de ratinho), a partir de colheita de embriões para a análise de dados (Figura 1B). A análise simultânea de várias ninhadas aumentaria a imagem e análise de dados a carga do tempo, aumentando assim o comprimento total do protocolo.
O embrião pré-implantação fase do rato é um sistema experimentalmente tratável que, dada a sua pequena dimensão e morfologia estereotipada 3, é bem adequado para em imagem toto de processos celulares com resolução de uma única célula. Para realizar uma análise dos sistemas de nível imparcial de um número estatisticamente relevante de embriões, um gasoduto de análise quantitativa automatizada é desejável. No entanto, devido à densidade elevada nuclear da massa celular interna (ICM) do blastocisto ( <strong> Figura 1A, 2D), plataformas de segmentação de imagem convencionais não conseguem fornecer uma precisão suficiente para estabelecer um fluxo de trabalho automatizado ou semi-automático. Por outro lado, a segmentação manual, ao mesmo tempo precisa, não permite o tratamento de grandes grupos de células e de embriões, nem é adequado para uma determinação reprodutível, imparcial das identidades das células – o que é especialmente crítico quando se estuda estágios de desenvolvimento onde os padrões de marcador expressão ainda não totalmente resolvida (por exemplo, não apresentam uma distribuição de binário através de uma população). Temos recentemente desenvolvido e validado um método de segmentação de imagens sob medida para embriões em estágio de pré-implantação do mouse e de células-tronco embrionárias (CES), que alcança alta precisão, enquanto que exigem intervenção mínima do usuário 4-8.
O gasoduto análise aqui apresentada gira em torno da ferramenta de segmentação de imagens baseado em MATLAB Modular interactivo Segmentação Nuclear (MIN) 4. MINS performs segmentação nuclear sem supervisão em grandes lotes de Z-pilhas confocal depois que o usuário tenha estabelecido um número mínimo de propriedades da imagem, usando uma interface gráfica de usuário (GUI) (Tabela 1) 4. Este oleoduto tem-se mostrado eficiente para a geração de dados de alto rendimento sobre a expressão da proteína e localização de células em ambos os tipo selvagem, tratados experimentalmente e os embriões e os CES 5-7 geneticamente modificado. No presente protocolo, descrevemos a aplicação de minutos para a segmentação de imagens de embrião pré-implantação de estágio. Para exemplos de desempenho minutos na CES consulte a 4,7. O passo de segmentação nuclear automatizado reduz significativamente a carga do tempo do processo de identificação de células, ao passo que as medições de intensidade espacial e de fluorescência permitem uma determinação imparcial de identidades de células e a geração de mapas tridimensionais dos domínios de expressão do gene e a posição da célula no embrião (figura 1C </strong>). Além disso, a escalabilidade desse fluxo de trabalho faz com que seja aplicável à análise das ninhadas individuais através de grandes grupos de embriões tratados experimentalmente, ou embriões de diferentes origens genéticas 5,6. MINS está livremente disponível em http://katlab-tools.org (o software requer uma licença MATLAB).
Nenhuma abordagem desenvolvida até à data permite a geração desses dados aprofundados sobre a expressão da proteína e localização de células em embriões de rato pré-implantação. Todas as tentativas até agora a quantificar estes tipos de dados foram restritos à determinação manual e quantificação do número de células para diferentes populações no embrião (seja inteiramente manualmente ou software assistida) 9-19. Esta abordagem (incorporando software minutos) foi adaptado e testado em embriões pré-implantação do mouse e CES; no entanto, o seu desempenho em outros sistemas com a densidade nuclear de alta, embora ainda não foi testada, é esperado para ser equivalente.
Protocol
Representative Results
Discussion
O presente protocolo descreve um método para realizar uma análise quantitativa de toda mount-imunofluorescência na pré-implantação embriões estágio do mouse. Um protocolo de imunofluorescência robusta 22 é seguido de alta resolução, todo-mount imagem confocal e por segmentação de imagens usando um pedaço sob medida de software 4. Embora a escolha do protocolo de imunofluorescência não é crítica, nós encontramos o apresentado aqui 22 para ser rápido, fiável e para fo…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan and Panagiotis Xenopoulos, for input on data handling, analysis and representation, Berenika Plusa for assistance in the design of the immunofluorescence protocol and antibody testing and members of the Hadjantonakis lab for comments on the manuscript and on the development of this protocol. Work in our lab is supported by the National Institutes of Health R01-HD052115 and R01-DK084391, and by NYSTEM N13G-236.
Materials
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, overnight fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to overnight fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
Referencias
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