通过重组腺相关病毒载体注射立体的α-突触核蛋白基于大鼠模型为帕金森氏病的发展
Summary
This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson’s disease.
Abstract
为了研究帕金森氏病（PD）的分子途径，并制定新的治疗策略，科学调查依靠动物模型。的PD-相关基因的鉴定已经导致遗传的PD模型的发展。大多数转基因α-SYN的小鼠模型开发逐渐α-SYN病理，但未能显示效果清晰多巴胺细胞损失和多巴胺相关的行为缺陷。这一障碍，通过用病毒载体过量表达的PD-相关基因的黑质的直接靶向克服。使用病毒载体本地基因递送提供了一个有吸引力的方式来表达在中枢神经系统中的转基因。特定的大脑区域可以靶向（ 例如黑质），表达可在成人设置被诱导，并且可以达到高表达水平。此外，可以使用基于各种病毒不同载体系统。的协议概括了所有关键步骤来执行的病毒载体注射的大鼠的黑质开发用于帕金森氏病的病毒的基于矢量的α-突触核蛋白的动物模型。
Introduction
研究PD的病理生理学和开发新的治疗策略，对于动物模型可以非常类似于人PD的神经病理学，生理和运动症状的迫切需要。较高的预测值，我们就能更好地转化动物模型的新疗法给患者。
α-突触核蛋白的发现（α-SYN）在1997年第一PARK基因导致了第一个基因PD模型的发展。许多表达人野生型（WT）或突变（A30P，A53T）的转基因小鼠α-SYN已在过去十年中产生的。 α-SYN过表达的水平已被证明是在病理学的发展是至关重要的。另外，小鼠品系，内源性α-SYN的和是否全长或截短形式表示存在或不存在，播放（由洋红色和Chesselet 1详细审查）的作用。 WT和人类的几个临床突变体的过表达＃945; -SYN在转基因小鼠诱导α-SYN病理累积和神经元功能障碍2-6。然而，直到现在大多数转基因α-SYN的小鼠模型未能显示效果清晰多巴胺细胞损失和多巴胺相关的行为缺陷。
这种障碍是由黑质（SN）用病毒载体过表达α-SYN的直接针对克服。病毒载体是从病毒，可以很容易感染细胞，引入遗传物质引入其宿主基因组中，并迫使宿主细胞中复制的病毒基因组中，以产生新的病毒颗粒衍生的。病毒可以被工程化以保留其进入细胞并引入基因的能力的非复制的病毒载体。通过删除的病毒基因组的某些部分与由感兴趣的基因替换它们，载体的应用将导致在单轮感染而不会在宿主细胞中，通常被指定为“转导”复制。病毒载体Ç一个同时用于过表达和基因沉默。所表达的转基因可以是一个报告蛋白（ 例如绿色荧光蛋白或萤火虫萤光素酶）7，治疗性蛋白质的基因治疗应用8-10，或如我们将集中于在本文中，用于疾病建模11的疾病相关蛋白质-14。
病毒载体介导的基因递送提供了另一种方式来表达在CNS转基因与几个优点。利用当地的转基因传送，特定的大脑区域可以有针对性。此外，转基因的表达可以减少成年后的补偿机制发展过程中的风险过程中引起的。此外，可以在不同的物种和株被创建的模型。最后，不同的转基因可以很容易地进行组合。使用病毒载体，高转基因表达水平可以实现，因为该疾病发病和严重程度常常取决于曝光过度的水平，这可能是重要的ression。
根据不同的病毒数载体系统已经开发出来。载体系统的选择依赖于感兴趣的基因，基因表达，靶细胞和生物安全问题的需要的持续时间的大小。在大脑中，慢病毒（LV）的稳定的基因转移和重组腺相关病毒（腺相关病毒）载体现在被认为是选择的载体系统，因为它们导致在啮齿动物脑有效和长期的基因表达。对于SN的多巴胺能神经元（DN）特异性靶向，腺相关病毒载体已逐渐outcompeted由于其较高的效价和DN的转染效率的LV载体。
目前可用的最佳α-SYN基于啮齿动物模型已经从使用较新的AAV血清型的组合的方法显影（腺相关病毒1，5，6，7，8）和优化的载体构建体，滴度和纯度15,16。载体滴度以及载体纯度直接影响该模型的表型结果。过度载体滴度或充分纯化的载体批次，可能会导致非特异性毒性。因此，适当的控制向量是不可缺少的。在病毒载体生产，像素提升和纯化过程相当长的时间也投资已经证明必不可少获得可重复性和高品质的矢量批次。
Protocol
Representative Results
Discussion
有该协议中的几个关键步骤。载体滴度以及载体纯度直接影响该模型的表型结果。过度载体滴度或充分纯化的载体批次，可能会导致非特异性毒性。因此，使用高品质的矢量批次，适当的控制载体是必不可少的。此外，鼠的头在立体框架的精确定位和坐标的精确确定是在指定目标的黑质是必不可少的。在注射部位钻在头骨的孔后，它在针插入直入老鼠的大脑不接触任何边距是重要的。针应注射病?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢里斯凡Asselberghs和安凡Santvoort的出色技术援助。研究由内陆水运-VLAANDEREN（IWT SBO / 80020），该FWO VLAANDEREN（G.0768.10）资助，由EC-FP6项目“迪米”（LSHB-CT-2005-512146）中，FP7项目RTD MEFOPA（HEALTH -2009-241791），在FP7计划“INMiND”（健康F2-2011-278850），在鲁汶（IOF-KP / 07/001，OT / 08 / 052A，IMIR PF / 10/017），和MJFox基金会（目标验证2010）。 A.范德Perren和C Casteels是科学研究的弗拉芒基金的博士后。 K.范Laere是科学研究的弗拉芒基金的高级研究员临床。
Materials
| Female 8 weeks old Wistar rats | Janvier | / | 200-250 g |
| Ketamine (Nimatek) | Eurovet animal health | 804132 | |
| Medetomidine (Dormitor) | Orion-Pharma/ Janssen Animal Health | 1070-499 | |
| Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel | Astrazeneca | 0137-547 | |
| Terramycine | Pfizer | 0132-472 | |
| Buprénorphine (Vetergesic) | Ecuphar | 2623-627 | |
| Jodium 1% isopropanol | VWR | 0484-0100 | |
| stereotactic head frame | Stoeling | / | |
| Hamilton Syringe (30 gauge -20mm -pst 2) | Hamilton/ Filter Service | 7803-07 | |
| atipamezole (Antisedan) | Orion-Pharma/Elanco | 1300-185 | |
| rAAV A53T α-SYN vector | LVVC, KU Leuven | / | https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/ |
| sodium pentobarbital (Nembutal) | Ceva Santé | 0059-444 | |
| microtome | Microm | HM650 | |
| rabbit polyclonal synuclein Ab | Chemicon | 5038 | 1:5000 |
| rabbit polyclonal TH Ab | Chemicon | 152 | 1:1000 |
| Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph | Siemens/ Concorde Microsystems | / | |
| radioligand: 18F-FECT | In house | / | |
| L-dopa: Prolopa 125 | Roche | 6mg/kg i.p. | |
| DMEM, Glutamax | Life Technologies | N° 31331-093 | |
| Foetal bovine serum | Life Technologies | N° 10270-106 | |
| 25 kD linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | / | |
| OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol | Sigma | D1556-250ML | |
| Optimen | Life Technologies | N° 51985-026 | |
| Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition | Elsevier | / |
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