Optische controle van een neuronaal proteïne met behulp van een genetisch gecodeerde Onnatuurlijke aminozuren in neuronen
Summary
Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.
Abstract
Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.
Introduction
Vergeleken met conventionele elektrische stimulatie, fotostimulering biedt meer temporele en ruimtelijke resolutie met een minimum aan interferentie met de fysiologische systeem van specimens. Sinds de demonstratie van het gebruik van lasers om neuronen te stimuleren in 1971 1, zijn veel creatieve manieren bedacht om exogeen controle neuronale activiteit met licht. Optische afgifte van photocaged agonisten is lange tijd gebruikt om fysiologische respons van het neuronale netwerk liganden 2,3,4 bestuderen. Deze techniek heeft een beperkte specificiteit door diffusie van gekooide agonisten. Genetische specificiteit wordt bereikt door ectopisch tot expressie lichtgevoelige opsin kanalen en pompen 5,6,7, en is met succes toegepast op geselecteerde neuronale netwerken in verschillende modelorganismen moduleren. Toch zou het moeilijk zijn om deze methode toe te passen optisch controleren van bepaalde neuronale eiwitten, aangezien enten photoresponsiveness van opsin eiwitten aan andere eiwitten would intense techniek die de natuurlijke eigenschappen van het eiwit kunnen veranderen bestudeerd vereisen. Chemisch tethering een exogene fotogevoelige ligand een eiwit is een andere manier om de functionaliteit van kanaalproteïnen 8,9,10 controle aangetoond. Het ligand wordt gepresenteerd of de bindingsplaats van het eiwit onttrokken door de foto-isomerisatie van het azobenzeen groep. Tethering chemie beperkt de toepassing voornamelijk aan de extracellulaire zijde van membraaneiwitten, exclusief de intracellulaire kant en intracellulaire eiwitten.
Licht aansprekend Uaas, na te zijn opgenomen in eiwitten, zorgen voor een algemene strategie om eiwitten te manipuleren met licht. In het begin van de inspanningen, tRNA chemisch geacyleerd met photocaged Uaas werden micro-injectie in Xenopus oöcyten om de Uaas nemen in membraan receptoren en ion kanalen 11, die aan het inzicht in de structuur-functie relaties 12,13,14.Deze micro-injectie aanpak is vooral beperkt tot grote eicellen. Genetische incorporatie van een UAA omzeilt de technisch uitdagende tRNA acylering en micro-injectie met behulp van een orthogonaal tRNA / synthetase paar, waarin de UAA verwerkt door middel van endogene eiwit vertaling in levende cellen 15,16,17,18. UAA incorporatie in neuronale eiwitten is aangetoond in primaire neuronen en neurale stamcellen 19,20. Recenter licht aansprekend UAA genetisch is opgenomen in een neuronaal eiwit in de hersenen van zoogdieren in vivo voor het eerst 21. Deze ontwikkelingen maken het mogelijk om neuronale eiwitten met Uaas bestuderen in hun natieve cellulaire omgeving.
Binnenwaarts rectificatie kaliumkanaal kir2.1 is een sterke gelijkrichter die K + stromen gemakkelijker overgaat in dan uit de cel, en het is essentieel bij het reguleren van fysiologische processen zoals mobiele exciteerbaarheid, vaattonus, hartslag, renal zout stroom en insuline vrij te geven 22. Overexpressie van kir2.1 hyperpolariseert de membraanpotentiaal van de doelwit neuron, minder prikkelbaar 23,24 wordt. Optisch kir2.1 beheersen zijn natieve cellen, Kang et al. Genetisch opgenomen een fotogevoelig UAA in kir2.1 expressie in zoogdierlijke cellen, neuronen en embryonale muizenhersenen 21. Een korte lichtpuls kon de UAA zetten in een natuurlijk aminozuur Cys, waardoor het activeren van het doelwit eiwit kir2.1. Toen deze foto-induceerbare innerlijk rectificeren kalium (Pirk) kanaal eiwit werd uitgedrukt in de rat hippocampus primaire neuronen, is onderdrukt neuronale afvuren in reactie op licht activering. Bovendien werd de Pirk kanaal tot expressie gebracht in embryonale muis neocortex, en het licht-geactiveerde Pirk stroom in corticale neuronen werd gemeten. De succesvolle implementatie van de OCG technologie in vivo in de hersenen van zoogdieren opent de deur naar optisch controle neuronale eiwittenin hun natieve omgeving, waardoor optische dissectie van neuronale processen en mechanismen op moleculair niveau mogelijk te maken.
In dit protocol beschrijven we de procedures voor genetische incorporatie van Uaas in primaire neuronen in cultuur en in de embryonale muizenhersenen in vivo. Het licht aansprekend UAA Cmn en kir2.1 worden gebruikt om het proces te illustreren. Methoden om succesvolle UAA integratie en optische controle van neuronale eiwit activiteit zijn voorzien te beoordelen. Dit protocol geeft een duidelijke leidraad genetisch coderen Uaas in neuronen en in vivo, en optisch reguleren neuronale eiwitfunctie via een op licht aansprekend UAA. We verwachten dat dit protocol bij de vaststelling van de in vivo OCG-technologie voor neurowetenschappen en optogenetic biologische studies vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om effectief foto-modulatie te bereiken, de belangrijke eerste stap is om te beslissen waar het licht aansprekend UAA te nemen in het doelwit eiwit. Structurele en functionele informatie van het doeleiwit is zeer nuttig om de selectie van kandidaatsites leiden. Tegelijkertijd zou het doel van lichtregeling bepalen welke site het meest geschikt. Na het kiezen van de kandidaat-sites, raden wij aan om de sites in zoogdiercellijnen zoals de humane embryonale nier (HEK) cellen voor gemakkelijker cultuur en manipulatie, te te…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. S. Szobota for helpful discussion on neuron culture and Ca-P transfection. L.W. acknowledges support from The Salk Innovation Grant, the California Institute for Regenerative Medicine (RN1-00577-1), and the National Institutes of Health (1DP2OD004744).
Materials
| Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm | Carolina Biologicals | 633029 |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine | Corning Discovery Labware | 354210 |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 |
| Iris Spatula-curved | Fine Science Tool | 10092-12 |
| Dissecting Knife – Fine Angled Tip | Fine Science Tool | 10056-12 |
| GlutaMAX-I Supplement | Life Technologies | 35050-061 |
| MITO+ Serum Extender | BD Biosciences | 355006 |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning Life Sciences | 352340 |
| BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) | Sigma-Aldrich | B6420 |
| LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 | Prizmatix Ltd. | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega | V2111 |
Referencias
- Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
- Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).
- Cambridge, S. B., et al. Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems. Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).
- Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
- Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
- Volgraf, M., et al. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).
- Szobota, S., Isacoff, E. Y. Optical control of neuronal activity. Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).
- England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).
- England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis. Bioquímica. 38 (43), 14409-14415 (1999).
- Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).
- Tong, Y., et al. Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel. J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).
- Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
- Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).
- Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).
- Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
- Wang, W., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).
- Kang, J. Y., et al. In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids. Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).
- Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).
- Burrone, J., O’Byrne, M., Murthy, V. N. Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons. Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).
- Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O’Rourke, B., Marban, E. Inducible genetic suppression of neuronal excitability. J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
- Molleman, A. . Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
- Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
- Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells. Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).
- Parrish, A. R., et al. Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).
- Lu, H., Klaassen, C. Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents. Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurociencias. 103 (4), 865-872 (2001).
- Plaster, N. M., et al. Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen’s syndrome. Cell. 105 (4), 511-519 (2001).
- Priori, S. G., et al. A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene. Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).
- Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function. Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).
- Hoppmann, C., et al. Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
- Hoppmann, C., et al. In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light. J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).
