La evaluación simultánea de los cardiomiocitos de síntesis de ADN y la ploidía: Un Método de Ayuda a la cuantificación de los cardiomiocitos Regeneración y Facturación

Summary

Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

Abstract

Aunque se acepta que el corazón tiene un potencial limitado para regenerar los cardiomiocitos después de la lesión y que los bajos niveles de rotación de los cardiomiocitos se producen durante el envejecimiento normal, la cuantificación de estos eventos sigue siendo un reto. Esto es en parte debido a la rareza del proceso y el hecho de que múltiples fuentes celulares contribuyen al mantenimiento del miocardio. Además, la duplicación del ADN dentro de los cardiomiocitos a menudo conduce a un cardiomiocito poliploides y sólo rara vez conduce a nuevos cardiomiocitos por división celular. Con el fin de cuantificar con precisión el volumen de negocios de los cardiomiocitos discriminación entre estos procesos es esencial. El protocolo descrito aquí emplea etiquetado nucleósido a largo plazo con el fin de etiquetar todos los núcleos que han surgido como resultado de la replicación del ADN y los núcleos de cardiomiocitos identificados mediante la utilización de aislamiento de núcleos y posterior immunolabeling PCM1. En conjunto, esto permite la identificación precisa y sensible del etiquetado nucleósido de la cardiomyocyte población núcleos. Además, 4 ', el etiquetado y el análisis de la ploidía núcleos 6-diamidino-2-fenilindol, permite la discriminación de los núcleos neo-cardiomiocitos a partir de núcleos que han incorporado nucleósido durante polyploidization. Aunque este método no puede controlar para binucleación cardiomiocitos, permite una cuantificación rápida y robusta de núcleos neo-cardiomiocitos mientras que representa el polyploidization. Este método tiene una serie de aplicaciones posteriores, incluyendo la evaluación de los agentes terapéuticos potenciales para mejorar la regeneración de los cardiomiocitos o la investigación de los efectos de la enfermedad cardiaca en el recambio de los cardiomiocitos y la ploidía. Esta técnica también es compatible con las técnicas inmunohistoquímico aguas abajo adicionales, lo que permite la cuantificación de la incorporación de nucleósido en todos los tipos de células cardíacas.

Introduction

En los últimos años ha habido una acumulación de pruebas que cuestionan la suposición de que el corazón es un post-mitótico ^1,2 de órganos terminales diferenciadas. Sin embargo, la cuantificación del volumen de negocios de los cardiomiocitos y la regeneración sigue siendo un reto.

Las dificultades para identificar con precisión la generación de cardiomiocitos raras mediante técnicas de inmunohistoquímica estándar están bien reportaron ^3. Además, la fuente celular de la generación de cardiomiocitos sigue siendo incierto con la evidencia para las contribuciones de la proliferación de los cardiomiocitos, así como por la diferenciación de células madre ^4-6. Por lo tanto, el uso de modelos de linaje rastreo que requieren el conocimiento del fenotipo de cardiomiocitos progenitor es imposible y la cuantificación de la proliferación en una única población, incluyendo los cardiomiocitos, es inapropiado. Además un cardiomiocito tiene el potencial para endoreplication sin cariocinesis (que resulta en un coche poliploidediomyocyte) o cariocinesis en ausencia de la citocinesis (que resulta en un cardiomiocito binucleadas) ^7,8. La cuantificación precisa de la rotación de los cardiomiocitos depende de la capacidad de distinguir entre estos eventos y la verdadera generación de neo-cardiomiocitos. Esto crea complicaciones únicas porque la replicación del ADN y la expresión de las quinasas dependientes de ciclina en cardiomiocitos no demuestran exclusivamente división celular verdadero ^9,10.

Para ayudar en la cuantificación de la generación de neo-cardiomiocitos, hemos combinado una técnica de aislamiento núcleos establecido, y el etiquetado inmunológica de material pericentriolar 1 (PCM1) para la identificación de los núcleos de cardiomiocitos como se describe por Bergmann et al. ^7,11 con nuevos métodos de largo plazo marcaje de ADN y análisis de ploidía. PCM-1 es una proteína de centrosoma que se acumula en la superficie nuclear de diferenciados miocitos, no de ciclismo. Estudios previos han demostrado que los anticuerpos contraPCM-1 etiquetar específicamente núcleos de cardiomiocitos ^7,11 y, como tal PCM1 ha sido utilizado por un número de grupos independientes para identificar los cardiomiocitos ^1,12,13. Además, hemos demostrado que la expresión PCM1 asigna a núcleos de cardiomiocitos genéticamente etiquetados en el modelo CRE-TnT ratón transgénico ¹⁴ (Figura 1).

El protocolo descrito aquí permite la identificación precisa y sensible de la generación de cardiomiocitos núcleos neo en el corazón de ratón, independientemente de los orígenes celulares (Figura 1A y B) mientras que excluye simultáneamente etiquetado nucleósido debido a polyploidization del análisis (Figura 1C y D). Aunque este método no puede controlar para binucleación cardiomiocitos, permite una cuantificación rápida y robusta de núcleos neo-cardiomiocitos que se requiere para la cuantificación precisa de la rotación de los cardiomiocitos. Además,proporciona una herramienta de detección rápida para evaluar los posibles cambios en la dinámica de generación de cardiomiocitos.

Si bien el etiquetado de ADN implica generalmente 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) como el análogo de la timidina, el protocolo descrito aquí utiliza un ensayo de 5-etinil-2 'desoxiuridina (EDU), basado ya que requiere menos etapas de procesamiento para una más rápida a través de entradas y no requiere desnaturalización del ADN para la inmuno-detección, por lo que es compatible con otros protocolos de inmunotinción y aumentando así las posibles aplicaciones posteriores del método.

Figura 1: pulsante continuo con etiquetas EdU neo-cardiomiocitos, independientemente de sus progenitores. (A) EdU se incorpora en el ADN de los cardiomiocitos durante la división celular. La proliferación de los cardiomiocitos en la población será Result en un aumento de, o la sustitución de los cardiomiocitos y es por lo tanto la síntesis de ADN productivo (contribuye al mantenimiento y reparación de tejidos). (B) EdU se incorpora en el ADN de las células progenitoras cardiacas durante la división celular. Este será retenido en la célula durante la diferenciación al linaje de los cardiomiocitos. Esta diferenciación de células madre también dará lugar a un aumento en el número de cardiomiocitos y por lo tanto contribuye al mantenimiento y reparación de tejidos. (C) Los cardiomiocitos tienen la posibilidad de someterse a la replicación del ADN "no productivo" que resulta en aumento de ploidía de los cardiomiocitos, que está asociada con la hipertrofia de los cardiomiocitos y la remodelación del miocardio, pero no sustituye a los cardiomiocitos perdidos. El proceso de polyploidization difiere de binucleación ya que resulta en una cardiomiocitos con un solo núcleo, que contiene cuatro o más conjuntos de dos cromosomas homólogos (> 2N). (D) A raíz de una núcleos continua pUlse, este protocolo describe el aislamiento y la identificación de los núcleos de los núcleos de cardiomiocitos por expresión PCM1 para permitir la cuantificación de ambos ploidía de los cardiomiocitos y la incorporación EdU. PCM1 expresión y Edu incorporación detectado mediante citometría de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

el trabajo con animales fue autorizado y aprobado por el comité de revisión ética de la Universidad de Newcastle. Todos los procedimientos con animales se realizaron conforme a las líneas de la Directiva 2010/63 / UE del Parlamento Europeo sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos. 1. Administración EdU Disolver EdU en solución salina estéril (0,9% w / v) a una concentración final de 12,5 mg / ml. Calentar la solución a 40 ° C y agitar para disolver completamente. Almacenar suficiente EDU / solución salina a 4 ° C para inyectar todos los ratones en el estudio lo que permite 6 inyecciones diarias. Nota: Por lo general se requieren más de 6 ratones para cada grupo experimental. Sin embargo, los cálculos de potencia se deben realizar para estudios independientes. Pesar ratones individuales. Calcular el volumen necesario para administrar 100 mg / g de solución / solución salina EdU a cada ratón (8 l de solución madre EdU por g). Dibujar el volum apropiadae del EDU / solución salina en jeringa de insulina con una aguja de 25 G. Realizar intraperitoneal (ip) durante la manipulación de los ratones usando técnicas del Ministerio del Interior aprobados. Coloque el ratón en la tapa de la jaula. Tire suavemente de nuevo en la base de la cola y sujete firmemente el ratón por la piel. Exponer el abdomen para inyección Manteniendo el ratón con el dedo índice y el pulgar cerca de la base de la cabeza e inclinando la cabeza del animal hacia atrás hacia el piso. Limpiar el abdomen con una solución de alcohol 70%. Localiza la línea media del animal y en el cuadrante inferior derecho. Se inyecta la solución EDU / solución salina en el animal en el cuadrante inferior derecho. Inyectar ratones con solución / solución salina EdU y registrar la hora del día. Repetir los pasos 1.2 a 1.4 en el mismo momento del día, durante 6 días consecutivos. Nota: A medida que se requiere un control negativo EdU para ajustar la compuerta para el análisis de citometría de flujo, inyectar una edad adicional, el género y experimentalmente que coincidaed ratón con un volumen equivalente de solución salina sin edu. Esto proporcionará el control requerido (ningún control EDU). Este control debe ser incluido para cada estudio para permitir variaciones en los lotes de reactivos y citómetro configurado. 2. Los corazones de cosecha A las 24 h después de la inyección EdU 6º, sacrificar a los ratones por dislocación cervical (o un horario alternativo 1 de Ministerio del Interior aprobó el método). Lugar de los animales sacrificados en una posición supina y hacer incisión en la piel desde el centro del abdomen hasta el diafragma con tijeras quirúrgicas. Cortar el diafragma, y ​​sosteniendo el esternón lejos de la cavidad del cuerpo, corte bilateralmente para exponer el corazón. Levantar ligeramente el corazón y cortar los principales vasos sanguíneos del tracto de salida para diseccionar el corazón fuera de la cavidad torácica. Inmediatamente colocar el corazón en cada una de 15 ml tubo de centrífuga individual que contiene 10 ml de PBS enfriado a 4 ° C. Transferir los corazones a SEParate 10 cm placas de Petri, utilizando un escalpelo cortar cada corazón en dos en una orientación sagital y lavar el corazón apretando suavemente con un par de fórceps. A continuación, reemplace el PBS para eliminar la mayor cantidad de sangre posible. Repita este paso dos veces. Coloque ambas partes de cada corazón en el mismo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml individual. Continúe con el paso 3 o, alternativamente, almacenar las muestras -80 ° C como se detalla en los pasos 2.9 y 2.10. Usando una aguja 25 G, hacer un pequeño agujero en la tapa del tubo de microcentrífuga para evitar que la tapa de apertura debido a la expansión de los gases cuando se procesa el corazón. Etiqueta de cada tubo de microcentrífuga y colocar en un contenedor de nitrógeno líquido para congelar. Etiquetado 3. Los núcleos de disociación de los cardiomiocitos y Núcleos Nota: Este etiquetado de disociación y cardiomiocitos núcleos núcleos es una adaptación de la de Bergmann et al 11 Realice este procedimiento en todas las muestras inyectadas.con Edu y solución salina inyectada (sin control de EDU) control negativo. Ver Tabla 1 para la receta de soluciones que se requieren para llevar a cabo estos pasos. Para cada corazón para ser analizada, colocar 36 ml de 1% de BSA / PBS solución en un tubo de ultracentrífuga, se incuba durante 30 minutos, desechar la solución y luego dejar secar al aire. Nota: Este tubo se utiliza en el paso 3.6. Coloque los corazones congelados individuales sobre una placa de 10 mm en el hielo y carne picada con un bisturí que permite a los corazones se descongelan durante el proceso de picar carne. Coloque corazones picado en 15 ml de Tampón de Lisis Celular en un tubo de centrífuga de 50 ml y homogeneizar con un homogeneizador de sonda para 15 segundos a 25.000 rpm a temperatura ambiente. Añadir otros 15 ml de Tampón de Lisis Celular al tubo de centrífuga y transferir a un 40 ml Dounce con una mano de mortero grande despacho. Realizar 10 golpes con la mano del mortero y filtrar a través de 100 micras a continuación colador 40 micras de células en un tubo de centrífuga de 50 ml. Se centrifuga durante 10 minutos unat 700 xga 4 ° C y separar el sobrenadante. Resuspender el sedimento nuclear en 25 ml de sacarosa solución de gradiente y la capa de los núcleos celulares solución en la parte superior de 10 ml de solución de gradiente de sacarosa fresco en el tubo de ultracentrífuga preparado en 3.1 que contienen. Centrifugar a 13.000 xg durante 1 hora a 4 ° C usando un rotor de tubo de oscilación hacia fuera. Tras la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender el botón núcleos en 1.300 l de tampón de almacenamiento de núcleos en un tubo de 1.5 ml y etiqueta PCM1. Eliminar 300 l de la suspensión a un nuevo tubo de microcentrífuga y añadir 700 l de tampón de almacenamiento núcleos fresco. Etiquetar este tubo como control ISO. Añadir anti-PCM1 a una concentración final de 8 mg / ml al tubo de microcentrífuga etiquetado PCM1 y añadir el anticuerpo de control de isotipo IgG de conejo a una concentración de 8 mg / ml al tubo de microcentrífuga etiquetado de control ISO. Incubar toda la noche a 4 ° C. Tras incubación, centrifugar a 700 xg durante 10 min, descartar el sobrenadante, sustituir con 1 ml de tampón de almacenamiento núcleos fresco, resuspender y centrifugar de nuevo durante 10 min a 700 x g. Descartar el sobrenadante y reemplazar con 1 ml de tampón de almacenamiento núcleos fresco. Añadir 1 l de F (ab ') 2 Fragmento de IgG de cabra anti-conejo (H + L) de anticuerpos (FITC o tinte verde fluorescente equivalente) para alcanzar una concentración final de 2 mg / ml. Nota: El uso de un F (ab ') 2 fragmento de anticuerpo disminuye el potencial para el etiquetado no específica de las células inmunes incluyendo macrófagos y células B. tubos de envoltura en papel de aluminio para protegerlo de la luz y se incuban durante 1 hora a 4 ° C. 4. Detección de EdU Incorporación Diluir 10 veces más concentrada EdU tampón de reacción 1:10 con agua desionizada. Se centrifuga la PCM-1 e ISO suspensiones núcleos de control etiquetada a 700 xg durante 10 min, descartar el sobrenadante y resuspender el botón núcleos en 1 ml de1% de BSA / PBS solución. Lavar el sedimento de núcleos dos veces. Después del lavado final, descartar el sobrenadante y reemplazar con 100 l de EdU fijador. Envuelva los tubos en papel de aluminio para protegerlo de la luz y se incuba a temperatura ambiente durante 15 min. Lavar las muestras dos veces con 1 ml de 1% BSA / PBS solución, centrifugar a 700 xg y se incuba con una solución de permeabilización a base de saponina 1x a temperatura ambiente durante 15 min. Preparar 1x cóctel etiquetado EdU (Tabla 2). Se requerirá un mínimo de 2 reacciones de incluir el control edu. Añadir 500 l de 1x cóctel EdU etiquetado directamente a cada muestra que ya contiene los núcleos en 100 l de solución de permeabilización a base de saponina 1X y se incuba a temperatura ambiente protegido de la luz durante 30 min. Centrifugar a 700 xg y resuspender en 1 ml de 1% BSA / PBS y repetir este paso dos veces más. Se centrifuga a 700 xg, desechar el sobrenadante y reemplazar con 400 l de solución de tinción de ADN (véase la Tabla de Materiales). Nombre del reactivo 1. Tampón de Lisis Celular 0,32 M de sacarosa 10 mM Tris-HCl (pH = 8) 5 mM CaCl 2 acetato de magnesio 5 mM EDTA 2,0 mM EGTA 0,5 mM DTT 1 mM Solución Gradiente 2.Sucrose 2,1 M de sacarosa 10 mM Tris-HCl (pH = 8) acetato de magnesio 5 mM DTT 1 mM 3. tampón de almacenamiento núcleos (NSB) 0,44 M de sacarosa 10 mM Tris-HCl (pH = 7,2) KCl 70 mM 10 mM de MgCl 2 espermina 1,5 mM Tabla 1: Núcleos ingredientes de la receta tampón de aislamiento para todos los tampones usados ​​en la sección de protocolo 3 (disociación núcleos y etiquetado núcleos de cardiomiocitos).. 5. Análisis de citometría de flujo Nota: Realizar la citometría de flujo en núcleos aislados como se describió previamente 7,11,15. En primer lugar, crear un gráfico que describe dispersión frontal (FSC) y dispersión lateral (SSC) para permitir la discriminación de los núcleos de los desechos (Figura 2A). Crear un plan para discriminar los núcleos individuales de los agregados (Figura 2B) mediante el trazado de 4 ', 6-diamino-2-fenilindol)) área (DAPI (3-405 / 450/50-A) respecto a la altura (33-405 / 450 / 50-H). garantizar that el 3-405 / 450/50-A de la señal se recoge en la escala lineal para permitir la correcta determinación del contenido de ADN. Crear un gráfico que describe 488/535 / 30-A (PCM-1) frente al SSC y mostrar sólo los eventos de la puerta singlete creada en 5.2 con el fin de evaluar PCM-1 de expresión en la población singlete. Ejecutar la muestra de control de isotipo a fin de establecer un PCM-1 puerta positivo (Figura 2C). Ejecutar una pequeña cantidad de PCM1 etiquetado de ejemplo para comprobar la PCM1 expresar la posición de la población y gating. Crear un gráfico que describe SSC-A frente a 405/450 / 50-A (para detectar DAPI). En esta gráfica, pantalla sólo singlete Pcm1 núcleos que expresan, usando las puertas creadas en 5.3. Utilice esta parcela para crear una puerta jerárquico adicional que contiene sólo 2 N núcleos (Figura 2D). Crear un gráfico que describe 488/535 / 30-A contra 1-633 / 660/20-A para permitir la identificación de etiquetado EdU de la población que expresa PCM1 cardiomiocitos. Mostrar sólo los núcleos que son singlete, P CM1 + y 2N usando el gating anteriormente. Muestra de corazón correr desde ningún control EdU para configurar la puerta EdU positivo (Figura 2E). Crear la puerta apropiada para las células EdU +. Grabar y cuantificar singlete, 2N, núcleos PCM-1 que expresan las que han incorporado edu. El cálculo de esta población como un porcentaje del total de singlete, PCM1 + núcleos. Esto proporcionará la velocidad de generación de núcleos neo-cardiomiocitos, durante el período de pulso EdU 7 días, como un porcentaje de núcleos totales cardiomiocitos. Nota: Como la unión a ADN DAPI es estequiométrica la intensidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN. Determinar la ploidía en base a la intensidad de la / 450/50-A de la señal 405, como se ha descrito previamente 7. Para evaluar la ploidía dentro de la población total de cardiomiocitos utilizar la trama establecida en 5,5 y un gating estrategia basada en la concentración de ADN 7. /files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg "/> Figura 2:. Ventana de medida para cuantificar la estrategia de cardiomiocitos EdU incorporación y ploidía (A) Los núcleos están discriminado de desechos basados ​​en la dispersión frontal (FSC) y dispersión lateral (SSC). (B) Se crea una puerta lineal y la población se identifica singlete núcleos basados ​​en el marcaje con DAPI y la altura 405/450/50 vs señal de zona. (C) gating fluorescente permite la separación de los núcleos de cardiomiocitos núcleos (PCM-1-positivo) y no cardiomiocitos (PCM-1-negativos) de tejido del corazón. (D) La intensidad de la señal DAPI se utiliza para determinar la concentración de ADN y la ploidía de ese modo los núcleos de la población de los cardiomiocitos PCM1 +. En el ratón> 80% de los núcleos de cardiomiocitos son diploide (2n). (E) gating fluorescente permite la separación de 2 N, núcleos de cardiomiocitos que han incorporado EdU (PCM + / + EDU = 0,9%) a partir de 2 N, cardiomiocitos que no han incorporado EdU (PCM + educación). Todas las etapas se detallan en el protocolo 5.0. Ejemplo muestra de MDX -. / Y ratones en el fondo C57 / BL10 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Representative Results

Este método permite la cuantificación de aumento de la incorporación EdU debido a la división núcleos de cardiomiocitos mientras que el control para aumentar la polyploidization. El uso de un ensayo basado en BrdU, previamente demostrado que el corazón de los mamíferos responde a la pérdida de cardiomiocitos crónica, en el modelo de ratón mdx de distrofia muscular de Duchenne, con la regeneración de nuevos cardiomiocitos. Hemos utilizado los métodos descritos aquí para validar aún más nuestros resultados publicados y para demostrar la utilidad del protocolo. De acuerdo con el protocolo descrito; adultos (12 semanas de edad) ratones mdx BL10 y de control fueron pulsados ​​con una inyección diaria de EdU durante 7 días, informó anteriormente de forma estática para permitir el análisis entre los grupos experimentales 5,13. Análisis inmunohistoquímico de los corazones de impulsos demuestra la presencia de PCM1 expresar cardiomiocitos que han incorporado EdU (Figura 3A). usin Sin embargo, los datos obtenidosg inmunohistoquímico métodos pueden ser mal interpretados, como otros tipos de células que han incorporado EdU pueden ser identificados erróneamente como cardiomiocitos. Un ejemplo de esto se demuestra en la Figura complementario 1A y B. Además, los métodos inmunohistoquímico no distinguen polyploidization de la división nuclear. El análisis de citometría de flujo se detalla en este protocolo permite la rápida cuantificación de la división nuclear de cardiomiocitos en ratones mdx y de control, mientras que excluye células que habían incorporado EdU debido a polyploidization. Similar a los datos publicados previamente 13, el análisis reveló un aumento en las tasas de generación de núcleos neo-cardiomiocitos en los corazones de ratones mdx de edad en comparación con controles pareados (1,2% frente a 0,17%; Figura 3B y C). Figura 3: </strong> Cuantificación de EdU etiquetado cardiomiocitos en corazones de tipo salvaje y mdx. (A) Imagen de proyecciones Z-stack tomadas de 40 micras de espesor secciones de corazones mdx. PCM-1 que expresan núcleos de cardiomiocitos (verde) que ha incorporado EdU (rojo). flecha amarilla indica EdU etiquetado cardiomiocitos. i y II indica individuo EdU etiquetado cardiomiocitos que se muestran en el plano z. Núcleos marcados con DAPI (azul) (B y C) Citometría de flujo de núcleos aislados mostrando parcelas representativas 12-13 de la semana viejo tipo salvaje (C57 / BL10) y los ratones mdx (MDX – / y en el fondo C57 / BL10). (B) Histograma que muestra la intensidad DAPI y la discriminación entre 2 N y 2N> núcleos. (C) Las representaciones que muestran EdU incorporación en la población núcleos de cardiomiocitos 2N cuando se analizó como se detalla en este protocolo. Para todos los ratones Edu se administró durante 1 semana a partir de 12 semanas de edad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Complementario Figura 1:. PCM-1 es un marcador específico para los núcleos de cardiomiocitos utilizando el protocolo descrito núcleos fueron aislados del ratón transgénico doble producida mediante el cruce de ratones TNT cre-14 con la línea de reportero CRE sensible ROSA nT / nG 16. En la activación cre ratón resultante bajo el control de troponina T (TNT) promotor conduce a la expresión de GFP irreversible con se localiza en los núcleos. Núcleos marcados con el control de isotipo (Iso) demuestra la capacidad de identificar la expresión de GFP cardiomiocitos núcleos de población (488/530/30-A). Etiquetado de los núcleos con anti-PCM1 (anticuerpo secundario detectado por 633 a 660/20-A) demuestra la correlación de expresión PCM1 con el cardiomyocy expresan GFPpoblación núcleos te. En este ejemplo, el 98,8% de los núcleos de cardiomiocitos identificados por la actividad del promotor TNT, están marcadas por el anticuerpo PCM1. Por favor, haga clic aquí para descargar la Figura 1 complementario. Figura complementario. 2: Desafíos para la cuantificación de la renovación de los cardiomiocitos mediante técnicas inmunohistoquímico (A) 2D La imagen muestra dos PCM-1 que expresan núcleos de cardiomiocitos (verde) que parecen estar también marcado por Edu (rojo). Las flechas amarillas indican lo que parece ser cardiomiocitos que han incorporado edu. Esto es debido a la aparente co-localización de expresión PCM1 y etiquetado EdU cuando visualizado utilizando imágenes 2-dimensional. (B) Una proyección 3-dimensional de esta imagen identifica el EdU etiquetado células no son cardiomiocitos pero son células no cardiomiocitos suprayacentes PCM1 expresar núcleos de cardiomiocitos. C57 / BL10 a las 12 semanas de edad utilizado para los experimentos. Por favor, haga clic aquí para descargar complementa la figura 2A. Por favor, haga clic aquí para descargar complementa la figura 2B. componentes de la reacción Número de reacciones 2 5 PBS 875 l 2,19 ml protector de cobre 20 l 50 l colorante fluorescente picolilo azida 5 l 12,5 l reacción diluidatampón preparado en 4.1 100 l 250 l volumen total de reacción 1 ml 2,5 ml Tabla 2: EDU ingredientes del cóctel. Receta para el cóctel de etiquetado EdU requerido por la Sección 4 del protocolo (Detección de EdU incorporación).

Discussion

Para cuantificar con precisión el volumen de negocios de los cardiomiocitos y ensayos de regeneración deben distinguir entre la verdadera generación de cardiomiocitos y la división de ADN no productiva. Muchos estudios siguen ignorando estos hechos simplemente no productivas, la cuantificación de la proliferación de cardiomiocitos únicamente a través de la expresión de ciclina kinesis y marcadores del ciclo celular. Hasta la fecha, un único método que permite la cuantificación precisa de la rotación de los cardiomiocitos mientras que el control de estos eventos no productivos sigue siendo alusiva. En particular, sigue siendo difícil dar cuenta de los cardiomiocitos polyploidization que contribuye hasta ~ 65% de la replicación del ADN de los cardiomiocitos ^13. Por lo tanto para ayudar en la cuantificación exacta de la generación de cardiomiocitos hemos desarrollado un protocolo que permite la cuantificación robusta de los tipos de núcleos de cardiomiocitos neo excluyendo la replicación del ADN que resulta en un incremento de ploidía. Aunque este protocolo puede no discriminación entre los géneros neo-cardiomiocitosción y cardiomiocitos bi-nucleación, que pueden ser utilizados rápidamente y calcular con precisión el límite superior (que representan el ploidía) de generación de cardiomiocitos. Por lo tanto, este protocolo proporciona una herramienta de evaluación para evaluar los posibles cambios en las tasas de generación de cardiomiocitos y polyploidization en modelos de enfermedad o para evaluar la eficacia de la terapéutica potencial. Una vez que los cambios en la velocidad de generación de núcleos neo-cardiomiocitos se identifican utilizando este protocolo estudios posteriores se pueden utilizar para determinar si esto debido a cambios en la generación de cardiomiocitos de número de cardiomiocitos de nucleación, como se describió anteriormente ^2,13,17,18. Estos incluyen el uso de la dinámica de nucleación cuantificación cardiomiocitos histológicos durante el período de pulso o análisis de secciones de tejido obtenidos a partir de animales EdU pulsados ​​en comparar EdU incorporación en las poblaciones de cardiomiocitos mononucleadas y multinucleadas.

Debido a los bajos niveles de los cardiomiocitos rotación de esteprotocolo utiliza múltiples inyecciones de EdU lo largo de un período de 7 días. Esto también permite que la "persecución" de todas las posibles fuentes celulares de la generación de cardiomiocitos y permite la cuantificación de la generación de cardiomiocitos núcleos acumulada durante este período de tiempo. Dependiendo del estudio, este periodo de tiempo se puede ajustar para adaptarse a los niveles predichos de generación de cardiomiocitos. Para la cuantificación exacta de EdU incorporación en los núcleos de cardiomiocitos, es imperativo que no hay etiquetado no específica de los núcleos con el anticuerpo secundario usado para detectar PCM-1 reactividad. Por tanto, sería prudente para llevar a cabo experimentos de titulación de anticuerpos secundarios adicionales con el fin de optimizar este aspecto del protocolo, en particular si un anticuerpo secundario que no sea que se sugiere en este protocolo se va a usar. El protocolo descrito aquí utiliza PCM-1 de expresión para identificar los núcleos de cardiomiocitos. Si bien este es un marcador de cardiomiocitos establecido, marcadores alternativos se pueden utilizar para validardatos; estos incluyen anticuerpos específicos para la troponina T cardiaca que se ha identificado como parte localizada en los núcleos de cardiomiocitos ^1. Del mismo modo, las proteínas localizadas nucleares alternativos pueden ser utilizados para identificar y cuantificar EdU incorporación en las poblaciones de núcleos distintos de los de los cardiomiocitos. Es importante que todos los núcleos de cardiomiocitos que están experimentando activamente mitosis se excluyen del análisis, ya que se desconoce el destino de esta síntesis de ADN y puede resultar en la división celular o el aumento de ploidía. PCM1 se desmonta durante la fase M del ciclo celular, por lo tanto cardiomiocitos mitosis no será identificado por la expresión PCM1. Además, todos los núcleos en la fase s del ciclo celular deben ser excluidos de análisis posteriores. Esto se puede lograr por Supresión todos los núcleos con una intensidad DAPI por encima de la población 2N incluyendo aquellos con una intensidad DAPI entre el 2N y 4N poblaciones.

Aunque es cada vezaceptado que el corazón tiene la capacidad de sustituir los cardiomiocitos durante el envejecimiento normal y después de una lesión aguda, la fuente y el grado de este potencial sigue siendo controvertido. Además, las tasas dispares de rotación de los cardiomiocitos se han reportado ^1,7,20-22. Esto puede ser debido en parte a las dificultades en la identificación y la cuantificación de la generación de neo-cardiomiocitos ¹⁹ con precisión. Hasta la fecha la mayoría de los estudios se han basado sólo en el uso del análisis histológico y la identificación de los cardiomiocitos a través de la expresión de proteínas citoplasmáticas, incluyendo proteínas del sarcómero, para la cuantificación del volumen de negocio de los cardiomiocitos y la renovación ^2,4,23,24. El uso de estos métodos para detectar la expresión de marcadores de proliferación, o como se ha demostrado aquí, la incorporación de análogos de timidina puede resultar fácilmente en el error de identificación de otros tipos de células cardiaca como cardiomiocitos. Mientras que el uso de la imagen confocal 3D puede ayudar a aliviar estos problemas thESE métodos son caros y lentos. Curiosamente, el protocolo descrito aquí demuestra neo-cardiomiocitos generación núcleos se produce a un ritmo de 0,17% por semana. Esto es consistente con otra citometría de flujo que demuestran los estudios basados ​​tasas de rotación semanales de hasta 0,13% ^5. Aunque es tentador para extrapolar las tasas de rotación anual sobre la base de estos datos, al igual que en estudios previos ^2,5,25,26, esto no es apropiado como las tasas de rotación son dinámicos durante el tiempo de vida de un animal ^13.

Este método tiene un número de aplicaciones potenciales, incluyendo la evaluación de los agentes terapéuticos potenciales para mejorar la regeneración de los cardiomiocitos o la investigación de los efectos de la enfermedad cardiaca en el recambio de los cardiomiocitos y las tasas de polyploidization cardiomiocitos.

Materials

0.32 M sucrose	Sigma	84100
10 mM Tris-HCl (pH = 8)	Sigma	T3253
5 mM CaCl2	Sigma	c5086
5 mM magnesium acetate	sigma	M-5661
2.0 mM EDTA	Sigma	E5134
0.5 mM EGTA	Sigma	63779
1 mM DTT	Sigma	D0632
70 mM KCl	Sigma	P9541
10 mM MgCl2	Sigma	M8266
1.5 mM spermine	Sigma	85590
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade	abcam	abc7415
Rabbit anti-PCM-1 antibody	Sigma	HPA023374
Alexa Fluor 488 F(ab')2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A-11070
cell strainers  70 μm and 100μm	Fisher scientific	11597522, 11517532
Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance	Sigma	D9188-1SET
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)	Life technologies	A10044
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit	Life technologies	C10634	This kit inlcudes  reagents required for section, EdU reaction buffer,  EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail.
CyStain DNA 2 step kit,	Sysmex Partec	05 5005	This kit inlcudes  reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution)
Probe homogeniser e.g. TissueRuptor	Qiagen	9001273
TissueRuptor Disposable Probes	Qiagen	990890
ultracentrifuge	Sorvall
Facscanto II	BD Biosciences
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 mL, 25 x 89 mm	Beckman Coulter	326823
Bovine serum albumin	Sigma	A2153