Beurteilung der myofilament Ca²⁺ Empfindlichkeit Basiswert Cardiac elektromechanischen Kopplung

Summary

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca²⁺ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca²⁺ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Abstract

Herzinsuffizienz und Herzrhythmusstörungen sind die häufigsten Ursachen für Mortalität und Morbidität weltweit. Jedoch bleibt der Mechanismus der Pathogenese und myokardialen Funktionsstörung in dem erkrankten Herzen vollständig geklärt werden. Recent zwingenden Beweis zeigt , daß Änderungen in der myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit beeinflussen intrazellulärem Ca ²⁺ Homöostase und Ionenkanalaktivitäten in Kardiomyozyten, die wesentlichen Mechanismen , die für die kardialen Aktionspotentials und Kontraktion in gesunden und kranken Herzen. Tatsächlich Aktivitäten von Ionenkanälen und Transportern Herzaktionspotentiale zugrunde liegen (zB Na ^+, Ca ²⁺ und K ⁺ -Kanäle und der Na ⁺ -Ca ²⁺ Exchanger) und die intrazelluläre Ca ²⁺ Umgang mit Proteinen (z. B. Ryanodinrezeptoren und Ca ²⁺ -ATPase in Retikulum (SERCA2a) oder Phospholamban und seine Phosphorylierung) werden üblicherweise auf Evalu gemessenaßen die grundlegenden Mechanismen von Herz Erregung und Kontraktion (EG) Kupplung. Beide elektrischen Aktivitäten in der Membran und die intrazelluläre Ca ²⁺ Veränderungen sind die Triggersignale von EC – Kopplung, wohingegen myofilament die Funktionseinheit der Kontraktion und Entspannung, und myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit ist zwingend notwendig , bei der Umsetzung von Myofibrillen Leistung. Dennoch wenige Studien inkorporieren myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit in die funktionelle Analyse des Myokards , wenn es im Mittelpunkt der Studie. Hier beschreiben wir ein Protokoll , das Sarkomerverkürzung / re-Verlängerung und der intrazellulären Ca ²⁺ Ebene mit Fura-2 AM (ratiometrisch Erkennung) und bewerten die Veränderungen von myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit in Herzmuskelzellen aus Rattenherzen misst. Das Hauptziel ist , dass myofilament betonen Ca ²⁺ Empfindlichkeit sollte für mechanistische Analyse in Betracht EG Kupplung genommen werden. Umfassende Untersuchung von iauf den Kanälen, Ionentransporter, intrazellulärer Ca ²⁺ Handhabung und myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit , die myocyte Kontraktilität in gesunden und kranken Herzen zu Grunde liegen wird für die Gestaltung wirksamer Strategien der translationalen und therapeutischen Wert wertvolle Informationen liefern.

Introduction

Kardiale Erregungs Kontraktion (EC) Kopplung ist das Grundschema für die mechanischen Eigenschaften des Myokards Analyse, dh die kontraktile Funktion des Herzens ^1,2. EC Kopplung durch Membrandepolarisation sekundär zu den Aktivitäten von sarkolemmalen Ionenkanäle (beispielsweise die spannungsabhängigen Na ⁺ Kanal, der durch Patch-Clamp – Techniken gemessen werden kann) eingeleitet wird. Nachfolgende Aktivierung von spannungsabhängigen L-Typ – Ca ²⁺ -Kanälen (LTCC) und Ca ²⁺ -Einstrom durch LTCCs den Großteil der Ca ²⁺ -Freisetzung durch Ryanodin – Rezeptoren (RyRs) auslösen, die cytosolische Ca ²⁺ -Konzentration von nanomolaren Erhöhung (nM ) (uM) Ebene mikromolar. Eine solche Erhöhung der cytosolischen Ca ²⁺ Ca ²⁺ fördert die Bindung an Troponin C (TnC) in dünnen Fäden und entlockt Konformationsänderungen des Filaments Komplex die Actin-Myosin – Wechselwirkung zu erleichtern , und erreicht myocardial Kontraktion ^3. Umgekehrt wird die cytosolische Ca ²⁺ erneut uptaken zurück in das sarkoplasmatische Retikulum (SR) durch die Ca ²⁺ -ATPase in SR (SERCA2a) oder aus dem Myozyten über das Na ⁺ / Ca ²⁺ -Austauscher und dem Plasmalemma extrudiert Ca ²⁺ ATPase ^1,2. Folglich stiftet der Rückgang der cytosolischen Ca ²⁺ Konformationsänderungen von dünnen Fäden wieder in den ursprünglichen Zustand, was zur Dissoziation von Aktin-Myosin und myocyte Entspannung ^1-3. In diesem Schema wird die Aktivität von SERCA2a allgemein als die Geschwindigkeit der myokardialen Entspannung zu bestimmen , weil es für die 70 – Konten – 90% der cytosolischen Ca ²⁺ Entfernung in den meisten Säugetierherzzellen ^1. Als solche anormalen Handhabung Ca ²⁺ von LTCC, RyR und SERCA2a usw. hat die primären Mechanismen für beeinträchtigte Kontraktilität und Entspannung in das kranke Herz ^1-4 betrachtet.

<p class="jove_content"> In Wirklichkeit frei cytosolischen Ca ²⁺ , die Funktionen als der Bote in der EG – Kopplung entfallen rund 1% der gesamten intrazellulären Ca ²⁺ und die Mehrheit der Ca ²⁺ gebunden ist , an intrazelluläre Ca2 ⁺ Puffer ^5,6. Dies ist aufgrund der Tatsache , dass verschiedene Ca ²⁺ Puffer in Herzmyocyten reichlich vorhanden sind, beispielsweise Membran – Phospholipiden, ATP, Phosphokreatin, Calmodulin, Parvalbumin, Myofibrille TnC, Myosin, SERCA2a und Calsequestrin in der SR. ^5,6,7. Unter ihnen sind SERCA2a und TnC die vorherrschenden Ca2 ⁺ Puffer ^5,6,7. Weiterhin ²⁺ Ca seiner Bindungspuffern während twitch ein dynamischer Prozess ist (beispielsweise 30-50% der Ca ²⁺ bindet an TnC und distanzieren von ihm während Ca ²⁺ Transienten ⁷⁾ und die Änderung in Ca ²⁺ Bindungs ​​Ursache zusätzlicher "Freigabe" von freiem Ca ²⁺ in das Cytosol führt zu den Veränderungen der intrazellulären Ca ²⁺ concentration. Folglich Störung der intrazellulären Ca ²⁺ Ebene induziert abnorme myofilament Bewegungen, die die Vorläufer der Kontraktions Dysfunktion und Arrhythmien ^8,9. Viele Faktoren (sowohl physiologische und pathologische) können die Quellen der post-transkriptionalen Modifikationen myofilament Proteine ​​sein, die myofilament Ca ²⁺ Pufferung und myofilament ^{2+ 8-10} Empfindlichkeit Ca beeinflussen. Vor kurzem wurde berichtet , dass Mutationen in myofilament Proteine ​​, die die Ca ²⁺ erhöhen Bindungsaffinität und die intrazelluläre Ca2 ⁺ Handhabung, die Auslösung Pause abhängige Potenzierung von Ca ²⁺ Transienten, abnormal Ca ²⁺ Freisetzung und Arrhythmien ^8. Im Einklang mit diesem Konzept haben wir auch , dass myofilament Ca ²⁺ Desensibilisierung bei hypertensiven Rattenherzen sekundär auf die Hochregulation der neuronalen Stickstoffmonoxid-Synthase mit erhöhten systolischen und diastolischen Ca ²⁺ Ebenen zugeordnet gezeigt^11, die wiederum ¹² die Anfälligkeit der LTCC auf Ca ²⁺ -abhängigen Inaktivierung erhöht. Daher ist myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit ein "aktives" Regulator der intrazellulären Ca ²⁺ Homöostase und Myozyten kontraktilen Funktion. Es ist notwendig geworden , Wechselwirkungen zwischen myofilament und Ca ²⁺ zu analysieren Proteine ​​für die gründliche Untersuchung von myocyte EG – Kopplung und die Herzfunktion Handhabung.

Hier beschreiben wir ein Protokoll , das die Veränderungen der myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit in isolierten Kardiomyozyten bewertet. Umfassende Analyse der intrazellulären Ca ²⁺ Profil, myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit und Kontraktion werden neuartige Mechanismen der myokardialen Mechanik raben.

Protocol

Das Protokoll ist in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch die UN-National Institutes of Health veröffentlicht (NIH Publication No. 85-23, überarbeitet 1996). Es wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der Seoul National University (IACUC Zulassung Nr .: SNU-101213-1) zugelassen. 1. Puffer Vorbereitung (Tabelle Materialien und Geräte) Bereiten 300 ml frisches Isolationslösung am Tag des Experiments…

Representative Results

LV Myozyten werden aus normalen und hypertensiven Rattenherzen isoliert. Stabförmige Myozyten mit klaren Riefen (die Sarkomere) und stabile Kontraktionen in Reaktion auf Feldstimulation werden als die optimale Myozyten zu sein und sind für die Aufnahmen (2A) ausgewählt. In dem Beispiel in F ild 2A gezeigt ist , -beladene a Fura 02.00 LV Myozyten ist horizontal und die Blende der Kamera positioniert ist , so eingestellt, dass die Myozyten der größte …

Discussion

Hier beschreiben wir die Protokolle Änderungen von myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit in einzelnen isolierten Kardiomyozyten zu bewerten und betonen die Bedeutung der Messung dieser Parameter neben elektrophysiologischen Eigenschaften, die intrazelluläre Ca2 ⁺ Transienten und myofilament Dynamik. Dies liegt daran, die Aufnahmen von einem oder zwei der Parameter können die Mechanismen zugrunde liegenden Herzkontraktion und Entspannung nicht expliziert. Im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren , di…

Materials

Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
		CFA300
		PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM