Evaluación de los miofilamentos Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilidad cardíaca subyacente excitación-contracción de acoplamiento

Resumen

Este artículo describe un protocolo que evalúa los cambios en la sensibilidad del miofilamento Ca²⁺ durante la contracción en miocitos cardíacos aislados del corazón de rata. Junto con la electrofisiología cardíaca, los niveles de Ca²⁺ del citosol sistólico/diastólico y la contracción/relajación, esta medición es imprescindible para respaldar los mecanismos que median el acoplamiento de excitación-contracción cardíaca en corazones sanos y enfermos.

Resumen

La insuficiencia cardíaca y arritmias cardíacas son las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. Sin embargo, el mecanismo de la patogénesis y el mal funcionamiento del miocardio en el corazón enfermo aún no ha sido aclarado. Evidencia convincente reciente demuestra que los cambios en la sensibilidad a la myofilament Ca ²⁺ afectan Ca intracelular ²⁺ actividades homeostasis y de los canales iónicos en los miocitos cardiacos, los mecanismos esenciales responsables de potencial de acción cardíaco y la contracción en corazones sanos y enfermos. De hecho, las actividades de los canales iónicos y transportadores subyacentes potenciales de acción cardiacos (por ejemplo, Na ^+, Ca2 ⁺ y canales de K ⁺ y el intercambiador de Na ⁺ -Ca ²⁺⁾ y Ca ^{2 +} manejo proteínas intracelulares (por ejemplo., Receptores de rianodina y Ca ^{2 +} -ATPasa en retículo sarcoplásmico (SERCA2a) o fosfolamban y su fosforilación) se miden convencionalmente para Evalucomieron los mecanismos fundamentales de acoplamiento excitación-contracción cardiaca (CE). Ambas actividades eléctricas en la membrana y cambios intracelulares de Ca ²⁺ son las señales de disparo de acoplamiento CE, mientras que los miofilamentos es la unidad funcional de la contracción y la relajación, y la sensibilidad de los miofilamentos ^de Ca2 ⁺ es imprescindible en la aplicación de los resultados de las miofibrillas. Sin embargo, pocos estudios incorporan sensibilidad myofilament Ca ²⁺ en el análisis funcional del miocardio a menos que sea el foco del estudio. A continuación, se describe un protocolo que mide el acortamiento del sarcómero / re-alargamiento y el nivel intracelular ^de Ca2 ⁺ con Fura-2 de AM (detección radiométrica) y evaluar los cambios en la sensibilidad de los miofilamentos ^de Ca2 ⁺ en los miocitos cardíacos de corazones de ratas. El objetivo principal es hacer hincapié en que myofilament Ca ^{2 +} sensibilidad debe ser tomado en consideración en el acoplamiento CE para el análisis mecanicista. investigación exhaustiva de ien los canales iónicos, transportadores, manejo intracelular ^de Ca2 ^+, y la sensibilidad de los miofilamentos ^de Ca2 ⁺ que subyacen en la contractilidad de los miocitos en corazones sanos y enfermos proporcionará información valiosa para el diseño de estrategias más eficaces de traslación y de valor terapéutico.

Introducción

Acoplamiento excitación-contracción cardiaca (CE) es el esquema fundamental para el análisis de las propiedades mecánicas del miocardio, es decir, la función contráctil del corazón ^1,2. Acoplamiento CE se inicia por despolarización de la membrana secundaria a las actividades de los canales de iones sarcolema (por ejemplo, el canal de Na ⁺ dependiente de voltaje, que se puede medir a través de técnicas de patch-clamp). La posterior activación de voltaje de tipo L de Ca ^{2 +} canales (LTCCs) y Ca ^{2 +} afluencia través LTCCs desencadenar la mayor parte de la liberación ^de Ca....

Protocolo

El protocolo está de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de la Salud de la ONU (NIH Publication No. 85-23, revisada en 1996). Fue aprobado por el Comité Institucional de animales Cuidado y Uso (IACUC) de la Universidad Nacional de Seúl (aprobación del IACUC no .: SNU-101213-1).

1. Preparación de búfer (Materiales y Equipo de mesa)

1. Preparar 300 ml de solución de aislamiento fresco en el día del experimento (en mM: NaCl, 135; KCl, 5,4; MgCl _2, 3,5; glucosa, 5; HEPES, 5; Na ₂ HPO _4, 0,4; taurina, 20; pH 7,4 con NaOH).

Resultados

miocitos LV están aisladas de corazones normales e hipertensos de rata. Miocitos en forma de varilla con estrías claros (que representa sarcómeros) y contracciones estables en respuesta a la estimulación de campo se consideran ser los miocitos óptimas y se seleccionan para las grabaciones (Figura 2A). En el ejemplo mostrado en la FIGURA 2A, un Fura 2 a.m. RESORTE LV miocitos se coloca horizontalmente y la abertura de la cámara se ajusta para que el mioci.......

Discusión

A continuación, describimos los protocolos para evaluar los cambios de la sensibilidad de los miofilamentos ^de Ca2 ⁺ en los miocitos cardíacos aislados única y hacemos hincapié en la importancia de medir este parámetro junto con las propiedades electrofisiológicas, intracelular de Ca ^{2 +} transitorios, y la dinámica de los miofilamentos. Esto se debe a las grabaciones de uno o dos de los parámetros no pueden explicar los mecanismos subyacentes de la contracción cardíaca y la relajación. A.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sprague Dawley rata	Koatech		8-12 semanas
Pentobarbital Sodio	Hanlim Pharmaceutical (Corea)	AHN901	Código de seguro:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucosa	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Manitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodio Piruvato	Sigma	P2256
Taurina	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Albúmina Fetal Bovina	Sigma	A7906
Colagenasa Tipo 2	Worthington	LS004177
Proteasa	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Sondas moleculares	F1221
Pluronic F127 Solución al 20% en DMSO	Invitrogen	P3000MP
Baño de agua agitado	Chang Shin Modelo científico	: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Constructor experimental	Adquisición y análisis de datos de acoplamiento de CE en miocitos
Calcio de miocitos y Sistema de registro de contractilidad	IonOptix Ltd
Baño de agua circulante	BS-Tech	BW2-8
Microscopio de fluorescencia de miocitos	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescencia & Detección de video	IonOptix	MyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescencia & Interfaz del sistema	IonOptix	FSI700
Fuente de luz de excitación	IonOptix	mSTEP
Lámpara ARC de alta intensidad Fuente de alimentación	Cairn Reseach
Controlador de rueda de filtro	IonOptix	GB/MUS200
Estimulador digital	médicos Corportion	S-98 Mutimode
Composiciones de soluciones experimentales
Name	Company	Número de catálogo	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentración (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentración (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentración (mmol) 5
Glucosa	Sigma	G8270	Concentración (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentración (mmol) 3.5
Taurina	Sigma		CB2742654 Concentración (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentración (mmol) 0.4
Solución de almacenamiento (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentración (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentración (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentración (mmol) 10
Glucosa	Sigma	G8270	Concentración (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentración (mmol) 0.2
Manitol	Sigma	M4125	Concentración (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentración (mmol) 5
Piruvato de sodio	Sigma	P2256	Concentración (mmol) 5
Taurina	Sigma	CB2742654	Concentración (mmol) 20
Solución de perfusión (solución de tirodo, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentración (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentración (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentración (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentración (mmol) 10
Glucosa	Sigma	G8270	Concentración (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentración (mmol) 1.8          Para la carga de Fura 2AM, las concentraciones de CaCl2 son 0,25 mM y 0,5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentración (mmol) 1
Manitol	Sigma	M4125	Concentración (mmol) 14.5
Solución de Collangenasa 1
Solución de aislamiento (30 mL)
Albúmina fetal bovina (solución BSA 5 ml)			Concentración (mmol) 1,67 mg/mL
Colagenasa tipo 2	Worthington		LS004177 Concentración (mmol) 1 mg/mL
Proteasa	Sigma	P6911	Concentración (mmol) 0,1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentración (mmol) 0,05 mM
Solución de colangenasa 2
Solución de aislamiento ( 20 mL)
Albúmina fetal bovina (solución BSA, 3,3 mL)	Concentración (mmol)
Colagenasa tipo 2	Worthington	LS004177	Concentración (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentración (mmol) 0,05 mM
			BSA
( 40mL)
Albúmina Fetal Bovina	Sigma	A7906	Concentración (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentración (mmol) 1mM

Sistemas 1,67 mg/mL, Solución de aislamiento de