IL-1βプロモーター駆動のDsRedレポーターマウスを用いた好中球プライミングの生体内イメージング
Summary
This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.
Abstract
好中球は人間の血液循環中で最も豊富な白血球であるとすぐに炎症部位に補充されます。プライミングは、好中球の貪食機能を強化し、重要なイベントです。広範な研究は、感染や傷害の間に好中球のプライミングの存在と重要性を発表しているが、 生体内でこのプロセスを可視化する手段が使用できなくなっています。蛍光結合抗リンパ球抗原の注入によって達成- 2）in vivoでの好中球の標識をプライミングの尺度として使用- 1）のDsRedレポーターシグナル：提供されたプロトコールは、3の方法論を組み合わせることにより、生きている動物にプライミング好中球のダイナミックなプロセスの監視が可能6G（Ly6G）モノクローナル抗体（mAb）、3）生体内共焦点画像化。いくつかの重要なステップは、このプロトコルに関与している：オキサゾロン誘発性マウス耳皮膚の炎症、動物の適切な鎮静、抗Ly6G mAbの反復注射、および前へ撮影時の焦点ドリフトのention。いくつかの制限は、1つのマウスでの連続撮影時間（〜8時間）の限界とフルオレセインイソチオシアネート – デキストラン炎症状態の血管からの漏出として、観察されているが、このプロトコルは、生体内イメージングのための基本的なフレームワークを提供します簡単にマウス炎症モデルにおける他の免疫細胞の検査に拡大することができる下塗りされた好中球の挙動と機能、。
Introduction
好中球は、循環中で最も豊富で短命白血球です。彼らは急速に彼らは抗菌ペプチドおよびプロテアーゼ1を含有する顆粒と一緒に活性酸素の放出および窒素中間体を介してプロの食細胞として機能し、感染または損傷の部位に動員されます。彼らの募集時には、好中球は炎症2の部位での到着時に顕著に強化された食細胞の機能で、その結果、微生物製品、化学誘引物質、および炎症性サイトカインを含む種々の薬剤によって「プライミングされた"されています。好中球のプライミングのメカニズムが広く試験管 3,4 に研究されています。しかしながら、 インビボでのプロセスの動的監視は、これまで不可能でした。
近年、生体内イメージングは、生体内の生物学的プロセスの細胞動態を可視化し、定量化するための重要な技術となっています。 Intraviタル画像は、従来の一光子励起顕微鏡（ 例えば、共焦点）を介して行うことができ、または多顕微鏡5に近づきます。時間が経つにつれて、かなりの改善が増加画像解像度、改善されたイメージング深さを可能にするこの技術で達成された、組織の光損傷、および強化された防振6,7を減少させました 。時間をかけて細胞移動および相互作用の動的可視化を可能にする独自の能力を考えると、生体顕微鏡は広く免疫学8に研究の多様な分野に適用されています。生体内イメージングは、よりよい生きている動物モデルの両方の細胞および分子レベルでの免疫応答を理解し、文脈する免疫学者を可能にします。
最近のトランスジェニックの進歩だけでなく、ノックインレポーターマウスは、生きている動物に好中球の動的挙動を監視するための有用なツールを提供してきました。リゾチームMプロモーター駆動強化緑色蛍光タンパク質ノックインマウスは広く溢出、細菌感染、および無菌性炎症9-15を含む種々の炎症性プロセスの間、好中球、単球、およびマクロファージの運動性を特徴づけるために使用されています。さらに、細胞質の蛍光共鳴エネルギー転移のバイオセンサーを発現するトランスジェニックマウスは、炎症性腸16内の好中球細胞外調節さマイトジェンキナーゼおよびプロテインキナーゼAの 活性を研究に使用されています。好中球における蛍光発現のための高い特異性を有するマウスモデルは、それ自体がリンパ球抗原6G（Ly6G）17の発現に結合された蛍光タンパク質tdTomato、ならびにCreリコンビナーゼを生成キャッチアップノックインマウス、です。このモデルを介したLy6G欠損好中球の可視化は、これらの細胞が生体内の炎症のコンテキストでの滅菌または感染の様々な通常の機能を発揮することが実証されています。 DsRedの蛍光Pを発現するトランスジェニックマウス好中球、炎症性単球、および活性化マクロファージを含むと考え – – （IL-1β）プロモーター（pIL1-DsRedの）はIL-1β産生細胞の運動性挙動を可視化するために利用されているinterleuikin-1βマウスの制御下に遺伝子をrotein新興炎症を起こした皮膚の18インチ
in vivoでの標識は、炎症を起こした組織中の好中球の細胞および分子の挙動を追跡するための代替的なアプローチとして機能することができます。蛍光標識した抗GR-1モノクローナル抗体（mAb）の低用量の静脈内注射した後、GR-1 +好中球の動員カスケードは、 黄色ブドウ球菌 19を感染させたマウスの皮膚病変で可視化されてきた。ストレプトアビジンを含む結合体のインビボ投与コンジュゲートさ705 nmの量子ドットおよびビオチン化抗Ly6G mAbが特異的に循環好中球20にラベルを付けます。 neutrophへのそのようなコンジュゲートのまた、エンドサイトーシスIL小胞間質への移行の好中球で高速小胞輸送の追跡を可能にする。P-セレクチン糖タンパク質リガンド-1（PSGL-1）、L-セレクチン（CD62L）に対する蛍光標識抗体とのin vivo標識、インテグリンαM（CD11bのTNFα誘導性炎症モデルにおける）およびケモカイン（CXCモチーフ）受容体2（CXCR2）は、初期の炎症の21時に遊んで調節機構を解明しました。偏好中球は、CD11bおよびCXCR2の再分配が生じ、活性化血小板上のCD62Lの存在と対話するためのPSGL-1に富んだuropods、好中球遊走を駆動し、炎症を開始する受容体を突出しています。
IL-1βは、下塗りされた好中球22に上昇しているシグネチャー遺伝子の一つです。 pIL1-DsRedのレポーターマウスにおいて、DsRedの蛍光シグナル（ すなわち 、IL-1βプロモーターの活性化）正にIL-1βmRNAの発現及びIL-1βタンパク質産生と相関します。<SUP> 18は、好中球のプライミングのプロセスを監視するには、生体顕微鏡法は、蛍光結合抗Ly6G mAbによる好中球のin vivo標識次pIL1-DsRedのマウスモデルにおけるオキサゾロン（OX）で皮膚の炎症の誘導を伴う開発されました。このモデルを介して、様々な疾患および障害の動物モデルにおいて好中球プライミングの動作及び機能を研究することが可能です。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究の目的は、まだ現在利用可能な技術によって満たされていない生きている動物における好中球のプライミングのプロセスを監視するための技術を開発することです。この目標を達成するために、3つの確立された方法が実行される：IL-1βプロモーター駆動のDsRedレポーターマウスの皮膚炎症の1）誘導プライミングの尺度として、蛍光結合抗Ly6Gの低用量での好中球の2）in vivo標識モ…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolysaccharides | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamine hydrochloride | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Hair-removal cream | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody | BioLegend | 127610 | |
| U-100 insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 Kda | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Butterfly infusion set (27 G needle) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur cytometer | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
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