This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.
Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient’s blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.
Con el fin de obtener los nutrientes necesarios para la supervivencia, los tumores malignos requieren acceso a la corriente sanguínea del paciente. Para conseguir que el acceso, las células tumorales liberan señales químicas que estimulan el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos en el tumor, secuestrando así el proceso fisiológico normal conocido como angiogénesis 2. Es también a través de los vasos sanguíneos creados a través de la angiogénesis que la metástasis (es decir, la propagación del cáncer a otros órganos) puede ocurrir. Debido a que el proceso de angiogénesis es tan vital para la progresión de una amplia variedad de cánceres, es un objetivo atractivo en la investigación de la terapia anticáncer 3.
Un método usado para cuantificar la angiogénesis es medir la capacidad de la célula progenitora endotelial para formar tubos cuando se colocan en una matriz extracelular. Debido a que la formación de estos tubos es un paso temprano crítico en la angiogénesis, las pruebas de las condiciones ambientales (por ejemplo, la presencia o ausencia de un co dadoformación mpound) que puede estimular o inhibir tubo da una idea de los pasos específicos que pueden ser objetivo de inhibir la angiogénesis. El ensayo de formación de tubo celular endotelial es uno de los 4 métodos más utilizados in vitro que mide la capacidad de las células para formar tubos. Es un ensayo simple, que requiere relativamente pocos componentes y un periodo de cultivo corto 5. Tal vez lo más importante, sin embargo, es que los datos obtenidos de este tipo de ensayo es cuantificable.
Un ejemplo para el uso del ensayo de formación de tubos consiste en comparar el desarrollo de tubos de células endoteliales vasculares cultivadas en matriz extracelular vs. factor de crecimiento reducido (FG) de la matriz extracelular. La matriz extracelular es un material de tipo membrana basal aislado a partir de células de sarcoma y sus principales componentes son laminina, colágeno de tipo IV, factores de crecimiento y los proteoglicanos. Algunos compuestos tienen diferentes efectos sobre la capacidad de la célula para formar tubos cuando enun entorno con una reducción de los factores de crecimiento y la reducción de proteoglicanos de sulfato de heparán (HSPGs). HSPGs son un componente de la matriz extracelular que se reduce de manera significativa en la TFG matriz extracelular. Como un ejemplo, si la hipótesis es que los inhibidores de la angiogénesis, tales como SB225002, que bloquea el receptor de CXCR2, tiene capacidad considerablemente más débil para interrumpir la formación del tubo cuando HSPGs son abundantes, a continuación, una comparación entre la actividad de la formación del tubo en la matriz extracelular y la matriz extracelular de GFR es importante en la exploración de la posibilidad de inhibición de la angiogénesis a través del control de los HSPG.
Otros ensayos que se utilizan comúnmente para determinar los efectos de los compuestos sobre la angiogénesis están es métodos in vivo. Ejemplos notables de esto son la membrana corioalantoidea de pollo (CAM) de ensayo 6 usando huevos de gallina, y el enchufe in vivo Matrigel ensayo de angiogénesis 7 usando ratones. Mientras que los métodos in vivo miden la angiogénesis en tres y las dimensiones son más representativos del cuerpo humano en comparación con el ensayo de formación in vitro del tubo, sufren el defecto de requerir mucho más tiempo y son mucho más difíciles de realizar. Tanto el ensayo de CAM y el ensayo enchufe extracelular toman al menos una semana 8 que hacer, mientras que en comparación, el ensayo de formación de tubos se puede realizar en un solo día y que no requiere el uso de animales.
Es importante tener en cuenta que las células endoteliales se utilizan en este informe son células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). Estas células juegan un papel clave en brote vascular y el crecimiento de los vasos sanguíneos, y son suficientemente análoga a las células endoteliales en los cánceres que se utilizará para evaluar la actividad anti-angiogénesis tanto in vitro e in vivo 9. Otras células, tales como células endoteliales microvasculares primarias también se pueden usar.
También es importante tener en cuenta que además de tener menorniveles de HSPG, la matriz extracelular de GFR también ha reducido los niveles de muchos de los componentes cuando se compara con la matriz extracelular normal. Esto incluye, pero no se limita a: EGF, IGF-1, PDGF, y TGF-beta. Aquellos que realizan experimentos que estudian el significado de estos compuestos en relación con la angiogénesis pueden estar interesados en el uso de la TFG matriz extracelular.
Al llevar a cabo este ensayo, es esencial para mantener la matriz extracelular en hielo oa 4 ° C en todo momento a menos que se especifique lo contrario. Si se permite que la matriz extracelular para calentar por encima de 4 ° C, se polimerizará, y el ensayo se arruinado. También es importante asegurarse de que cualquier cosa que entra en contacto (por ejemplo, puntas de pipeta, la placa) con la matriz extracelular es pre-enfriado por la razón antes mencionada. El número de células sembradas en cada pocillo es crítica, muy pocas células no dan la web esperada en la muestra de control, demasiadas células se forman grandes grupos de células o una monocapa y el ensayo no serán válidos. Otro factor importante en el éxito de este ensayo es el número de pases de células de la HUVECs. El número de paso siempre debe ser inferior a diez, de otro modo la formación del tubo robusto no puede producirse. Además, uno debe asegurarse de que el medio de cultivo celular que se utiliza no ha expirado, o las células no será viable. Alternativavamente, uno puede alícuota del medio y sus componentes y almacenar a -20 ° C para conservar por un período de tiempo después de la fecha de caducidad. Por supuesto, aún es preferible utilizar el medio antes de la fecha de caducidad
Como todos los procedimientos, existen algunas desventajas a realizar el ensayo de formación de tubos de células endoteliales. Un problema importante es que, debido a que hay diferentes tipos de células endoteliales y las matrices de apoyo, los resultados del ensayo pueden variar considerablemente en función de que se utiliza el tipo de célula y la matriz. Las células endoteliales (HUVEC utilizados, HAECs o HMVECs) son células primarias, que son costosos de obtener y tienen variabilidad en comparación con las células inmortalizadas. Las células primarias tienen pasajes limitados para el uso, y por lo tanto no son adecuados para los experimentos a largo plazo de la angiogénesis 14. Para los datos fiables, siempre se debe usar el mismo tipo para el ensayo. Como con otros ensayos in vitro, los resultados de un ensayo de formación de tubo deben ser conconfirmado in vivo, ya que los resultados de las condiciones controladas y artificiales de cultivo de tejidos de dos dimensiones no siempre se reflejan en el complejo sistema biológico de un organismo vivo. También es importante tener en cuenta que este tipo de ensayo sólo se puede utilizar para demostrar la formación de tubos de células endoteliales, y no debe ser utilizado para probar otro, no endotelial, células formadoras de tubo.
Este ensayo es un método bastante sencillo y rápido para cuantificar el potencial angiogénico de un compuesto. También forma una plataforma para experimentos adicionales, como solo, no da información sobre el mecanismo específico por el que el compuesto realmente afecta al proceso de formación de vasos. Sin embargo, el uso de matrices extracelulares variadas es un ejemplo de cómo crear, además, un marco para preguntas de investigación que no se utiliza comúnmente. Hay métodos para estudiar los mecanismos bioquímicos específicos del compuesto, incluyendo inhibidores específicos que se dirigen a componentes dela vía de la angiogénesis. Otro enfoque puede ser para extraer el ARN de las células endoteliales y el uso de RT-PCR (PCR en tiempo real) 12 para analizar las alteraciones de la expresión de genes que pueden causar el comportamiento del crecimiento observado en el ensayo. Las futuras aplicaciones de este método incluyen HUVEC transfectadas para crear ensayos de knock-down para los pasos específicos de la ruta de la angiogénesis. Existe la posibilidad de aplicar este enfoque para estudiar la vía de la LI. Mediante la alteración de los componentes de la matriz extracelular, la interacción de la matriz y el proceso celular de apoyo angiogénesis en el cáncer se puede explicará adicionalmente. La extracción de ARN y proteínas a partir de células endoteliales bajo estas condiciones específicas proporcionan datos cuantificables adicional correspondiente a la formación de imágenes de datos.
The authors have nothing to disclose.
The work was funded by the Fund for Medical Research and Education, Wayne State University, Detroit, MI.
EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 ) | Fisher | NC9525043 | HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin. Aliquot the medium and its components and store them at -20 oC, warm in 37 oC before use. |
MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10mL; LDEV-Free | Fisher | CB-40230 | Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in -20 oC , warm in 4 °C before use. |
MATRIGEL MATRIX 10ML ; 10mL; LDEV-Free | Fisher | CB-40234 | extracellular matrix, keep in -20 oC, warm in 4 °C before use. |
SB225002 | Fisher | 559405 | CXCR2 inhibitor, keep in -20 oC, warm in room temperature before use. |
Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ScienCell Research Laboratories | 8000 | culture it according reference 10. |
Trypsin 0.05%-EDTA phenol red | Invitrogen | 25300-054 | keep in 4 oC, warm in 37 oC before use. |
Nikon ECLIPSE Ti | Nikon | Inverted Research Microscope. | |
NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit | Nikon | Inverted Research Microscope software | |
Graph-pad Prism 5 | GraphPad Software, Inc. | scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50. |