Stencil Mikrostrukturierung von humanen pluripotenten Stammzellen für die Sondierung räumliche Organisation Differenzierung Fates

Summary

Humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) haben die intrinsische Fähigkeit zu differenzieren und sich selbst zu organisieren in verschiedene Gewebemuster; obwohl dies erfordert die Darstellung der räumlichen Umweltgradienten. Wir präsentieren Schablone Mikro als einfache und robuste Methode biochemische und mechanische Gradienten zu erzeugen, für HPSC Differenzierungsmuster zu steuern.

Abstract

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.

Introduction

Humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs), einschließlich embryonaler Stammzellen (hES-Zellen) und induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) werden in der regenerativen Medizin sowie experimentelle Modellierung von normalen und erkrankten Organogenese aufgrund ihrer Differenzierungspotential in Zelllinien aller weit ausgebeutet drei Keimschichten ^1,2. Die Differenzierung Schicksale von hPSCs sind sehr empfindlich auf lokale Umweltfaktoren , die ¹ autokrine oder parakrine modulieren können Signalisierung sowie Mechanotransduktion Prozesse durch körperliche Signale vermittelt ^3-5. Zelle Mikro umfasst eine Reihe von Techniken , die räumlich zu organisieren , um die Geometrie und die Position einer Zellpopulation als Mittel entwickelt wurden ³ die lokale zelluläre Mikroumgebung zu steuern, wie Zell-Zell – Wechselwirkungen ⁶ und Zell-Matrix – Wechselwirkungen. Im Rahmen der hPSCs wurde Zelle Mikro wichtige Erkenntnisse darüber zu gewinnen, wie beschäftigt Nischen abhängenent autokrine Signalisieren moduliert hESC Pluripotenz-Differenzierung Entscheidungen ⁷ und Organisation in der frühen embryonalen Differenzierungsmuster ^6. 2D- und 3D mikro hPSCs wurden verwendet , um die Koloniegröße von mehrzelligen Mustern zu steuern, die wiederum beeinflusst Differenzierungs Entscheidungen in die drei Keimschichten ^8,9. Wir haben vielzelligen HPSC Mikromuster verwendet , um das Ausmaß der Zell-Zell- und Zell-Matrix – Interaktionen innerhalb einer HPSC Kolonie zu modulieren , zu untersuchen , wie Integrin-E-Cadherin – Übersprechens ¹⁰ Anlass zu Zellschicksal Heterogenität geben kann. Die Demonstrationen aus den oben genannten Berichten eröffnen neue Wege in Richtung der Anwendung von mehrzelligen Mikro von hPSCs als experimentelle Modelle für Medikamententoxizität Screening auf Entwicklungsstörungen ^11, die Wirkung von Wachstumsfaktoren und Hormone während der Gewebe oder Organentwicklung zu studieren, und die Bildung von zu entwirren Gewebemuster.

Eine Vielzahl von Zell micropatterning – Techniken wurden von Falconnet et als prüft entwickelt. al. ¹² , aber nur eine Handvoll, wie Mikrokontaktdrucken ^7,8,13, Mikrowell – Kultur ^14,15, Photostrukturierungs ⁶ und microstencils ¹⁶ wurden mit hPSCs erfolgreich umgesetzt. Die Herausforderung mit Mikro hPSCs liegt in ihrer Verletzlichkeit und einer stringenten Bedingung von spezifischen extrazellulären Matrices (ECM) und die Wachstumsbedingungen für die Zellhaftung und Überleben. Für 2D HPSC Muster ist Mikrokontaktdrucken eine der gebräuchlichsten Methoden HPSC Mikromuster auf Gewebekultur und Glassubstrate ¹³ zu erzeugen. Das Verfahren kann gemeinsam Muster ECM in HPSC Kultur verwendet werden, einschließlich Laminin und Basalmembran-Matrices wie Matrigel. Allerdings erfordert es in der Regel einen zweistufigen Beschichtungsverfahren unterstützt von Poly-D-Lysine und benötigt spezifische inerten atmosphärischen und Feuchtigkeitsbedingungen stabil ECM Mikromuster zu machen für hPSCs auf ^6,13 zu befestigen. Die wichtigste Überlegung jedes Mikro Methode ist, ob die Oberflächenmodifikation Regime HPSC-Klebstoff ECM-Muster in der gewünschten geometrischen Auflösung bei gleichzeitiger Minimierung unspezifischer Zellbindung an die Umgebung erzeugen kann.

Hier berichten wir die Verwendung von Schablonenmikro als einfaches Verfahren HPSC Mikro ohne zusätzliche Oberflächenmodifikationsschritte vor der Erzeugung von Klebstoff ECM Muster zu erzeugen, um hPSCs zu befestigen auf. Die Zell Schablone besteht aus einer dünnen Membran, beispielsweise Polydimethylsiloxan (PDMS) -Folie, mit micron Durchgangslöchern bis Millimetergröße auf ein Substrat Zellkultur abzudichtenden physikalisch ECM Beschichtungen und anschließend beimpft hPSCs enthalten. Als Schablonenmuster durch physikalisches Zurückhalten der Position arbeitet, wo HPSC kann an dem darunterliegenden ECM beschichtete Substrat direkt zuzugreifen und diese befestigen, ist dieses Verfahren kompatibel mit verschiedenen Substraten, die HPSC Kulturen unterstützen kann. Die einzigen requirement ist, dass die Wahl des Schablonenmaterial eine reversible Dichtung mit dem Substrat bilden kann. Diese Substrate umfassen herkömmliche Gewebekultur – Polystyrol (TCPS) ^17, Liganden konjugiert Substrate ¹⁸ sowie elastomere Substrate mit abstimmbaren Steifigkeit (z. B. PDMS) ^19. Dieses Verfahren ermöglicht auch das Beschichten von verschiedenen ECM, wie Vitronectin (oder VTN – Protein), Laminin und Basalmembran Matrices (zB Matrigel und Geltrax) für die richtige Befestigung und die Differenzierung von hPSCs zu ermöglichen. Deshalb können wir für eine bestimmte HPSC Linie optimierte ECM-Substrat-Konfigurationen Transfer zum Schablone für eine optimale Zell-Matrix-Adhäsion, das Überleben und die Differenzierung Mikrostrukturierung. Kürzlich wurde ein ähnliches Verfahren auch hepatische Differenzierung von Mikro hESCs unter Verwendung von Poly (methylmethacrylat) (PMMA) Mikroschablonenanordnungen ¹⁶ zu leiten berichtet.

Zell Schablonen können aus verschiedenen Materialien hergestellt werden, einschließlich erfülltals ^20,21, Poly (p-xylylen) Polymere ^22,23, PMMA und ¹⁶ am häufigsten, PDMS ^24-28. Silicon und Poly (p-xylylen) Polymere Schablonen erfordern direkte Ätzen der Durchgangslöcher mit Spezialgeräten ^20-23, was deren Zugänglichkeit für die biologische Anwender einschränkt. PDMS Schablonen können durch verschiedene Verfahren hergestellt werden , in Abhängigkeit von der Merkmalsgröße benötigt, die typischerweise von 3 & mgr; m bis 2.000 & mgr; m reicht ^11,26-29. Wenn kleine Features gewünscht werden, dünne stenciling Blätter können durch Pressformen PDMS pre-Polymer auf einem mikrostrukturierten Silizium Vorlage mit Reliefs der Mikromuster ²⁸ hergestellt werden. Für Funktionen> 1000 & mgr; m, bietet ein CO ₂ Laser – Cutter eine einfache und kostengünstige Methode , um direkt die Muster auf einem bereits gegossenen PDMS Blatt während Schablonenherstellung geschnitten. Die Rezyklierbarkeit von PDMS Schablonen macht sie auch kosteneffektiv eine Reihe von Experimenten mit ausreichender Konsistenz durchzuführen.

<p class = "jove_content"> Hier präsentieren wir die detaillierte Methodik für die Herstellung eines PDMS Schablone mit 1000 um Funktionen durch Laserschneiden und die Erzeugung von hESC Mikro. Diese hESC Mikro wurden verwendet , um das Ausmaß der Integrin und E-Cadherin vermittelte Verwachsungen innerhalb einer zusammenhängenden hESC Kolonie zu modulieren , um zu untersuchen , wie räumliche Polarisierung der Zelladhäsion führte Zellschicksal Heterogenität ^10.

Protocol

Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von PDMS Schablone mit 1000 um Muster durch Laserschneiden und Mikrostrukturierung der hESC Linie, H9 die PDMS-Schablone verwenden. 1. Konstruktion und Herstellung von PDMS-Schablone zur Mikro Gestalten Sie das Schablonieren Blatt mit Durchgangslöchern der gewünschten Geometrie und Größe (zB 1000 um Kreise) und die Schablone Dichtung mit Computer-Aided – Design – Software – 10. Laser-schneiden S…

Representative Results

In diesem Papier beschreiben wir die Herstellung einer Zelle Schablone durch einen Laserschneider 1000 um Merkmale zu erzeugen. Die Schablone wurde aus 2 Teilen: einem dünnen Blech Schablonieren (ungefähr 100-200 & mgr; m dick), enthaltend die Mikrodurchgangslöchern und einem PDMS Dichtung die ECM Beschichtungslösung oder Zellsuspension zu enthalten. Hier, 127 & mgr; m und 2 mm dicken handelsüblichen PDMS Bleche wurden als Schablonieren Folie und Dichtung verwendet wurden. A…

Discussion

Die Herstellung von Mikro Schablonen

Stencil Mikrostrukturierung ist eine ideale Methode HPSC Mikro zur Untersuchung Nische vermittelte Differenzierung Strukturierung zu erzeugen. Der entscheidende Vorteil der Schablonenmuster über andere Mikrostrukturierungstechniken, wie Mikrokontaktdrucken und Photostrukturierungs, ist, dass sie nicht die Oberflächenmodifikation erforderlich ist und kann auf herkömmliche TCPS Substraten implementiert werden. Daher optimiert Ku…

Materials

2 mm thick PDMS sheet	Specialty Silicone Products Inc., USA	SSPM823-.005	Used to form reservoir for stencil
120-150 μm thick PDMS sheet	Specialty Silicone Products Inc., USA	SSPM823-.040	Used to form stencil
60 mm petri dish	Nunc Nunclon Delta	150326	Substrate for micropatterning
Accutase	Accutase, Merck Millipore, Singapore	SCR005	Enzyme to break H9 Cells into single cells
Activin	R&D Systems, Singapore	338-AC-010	Growth factor for H9 differentiation
BMP4	R&D Systems, Singapore	338-BP-010	Growth factor for H9 differentiation
Plasma system	Femto Science, Korea	CUTE-MP	For plasma oxidation of stencil
Dispase	StemCell™ Technologies, Singapore	7923	Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging
DMEM/F12	GIBCO, USA	11330032	Basal medium for H9 cells
FGF2	R&D Systems, Singapore	233–FB–025	Growth factor for H9 differentiation
H9 Cell line	WiCell Research Institute, Inc., USA	WA09	Human embryonic stem cells
hESC-qualified basement membrane matrix	Matrigel, BD Biosciences, Singapore	354277	Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells
Inverted microscope	Leica Microsystems, Singapore	DMi1	For capturing bright-field images
Laser cutter	Epilog Helix 24 Laser System		Used to generate through holes in PDMS sheet
mTeSR™1 medium	StemCell™ Technologies, Singapore	5850	Maintainence medium for H9 cells
PDMS	SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA	3097358-1004	Used for sticking the PDMS stencil and reservior
ROCKi Y27632	Calbiochem, Merck Millipore, Singapore	688000	Maintains H9 cells as single cells
STEMdiff™ APEL™ medium	StemCell™ Technologies, Singapore	5210	Differentiation medium for H9 cells
Polyethylene terephthalate film	SureMark Singapore	SQ-6633	Used to form stencil
Cell culture compatible non-ionic surfactant	Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore	P2443	Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates