VacuSIP, een verbeterde INEX Methode voor het<em> In Situ</em> Meten van Particulate en opgeloste componenten verwerkt door Active Suspension Voeders

Summary

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

Abstract

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

Introduction

Benthische schorsing feeders spelen een essentiële rol in het functioneren van mariene ecosystemen ^1. Door het filteren van grote hoeveelheden water ^2,3, ze te verwijderen en scheiden deeltjes (plankton en detritus) en opgeloste verbindingen ¹ (en referenties daarin) en zijn een belangrijk middel van benthische-pelagische koppeling ^4,5 en voedselkringloop ^6,7. Nauwkeurig meten van de deeltjes en opgeloste stoffen verwijderd en uitgescheiden door benthische schorsing feeders (zoals sponzen, ascidians, borstelwormen en tweekleppigen) is fundamenteel voor hun fysiologie, metabolisme en het voeden van de ecologie te begrijpen. Samen met pompsnelheid metingen, maar maakt het ook mogelijk een kwantificering van de nutriënten gemedieerd door deze organismen en de ecologische invloed op de kwaliteit van het water als op het ecosysteem grootschalige processen.

Het kiezen van de juiste methode voor het meten van verwijdering en productiesnelheden van deeltjes en opgeloste compond door ophanging filter feeders is van cruciaal belang voor het verkrijgen van betrouwbare gegevens over hun voedselopname ^8. Zoals opgemerkt door Riisgård en anderen, ongepast methodieken vooroordelen resultaten, vervormen experimentele omstandigheden, produceren onjuiste schattingen van de inname en uitscheiding van bepaalde stoffen, en kan leiden tot foutieve kwantificering van de nutriënten verwerkt door deze organismen.

De twee meest gebruikte methoden om deeltjes en opgeloste nutriëntfluxen in filter feeders meten betrekken ofwel incubatie (indirecte technieken) of gelijktijdig verzamelen van omgevings- en uitgeademde water (directe technieken). Incubatie technieken zijn gebaseerd op het meten van de verandering in de concentratie van deeltjes en opgeloste voedingsstoffen in het water geïncubeerd, en het schatten productiesnelheden of verwijdering vergelijking aan afdoende ^8. Echter, het omsluiten van een organisme in een incubatie kamer kan zijn feedin verandereng en pompen gedrag als gevolg van veranderingen in de natuurlijke stroming regime door een daling in zuurstof en / of voedselconcentratie of door accumulatie van verbindingen uitscheiding in de incubatie ^7,9 water (en referenties daarin). Naast de effecten van de begrenzing en gewijzigd water, een grote voorspanning van incubatie technieken voort uit re-filtratie effecten (zie bijvoorbeeld ^10). Hoewel sommige van deze methodologische problemen zijn overwonnen door de juiste omvang en vorm van het incubatievat ¹¹ of de introductie van een recirculerend stolp systeem in situ ^12, deze techniek vaak onderschat verwijdering en productiesnelheden. Kwantificeren van de stofwisseling van opgeloste stoffen zoals opgeloste organische stikstof (DON) en koolstof (DOC) of anorganische nutriënten, heeft bewezen bijzonder gevoelig voor vertekeningen veroorzaakt door incubatie technieken ¹³ worden.

In de late jaren '60 en vroege jaren '70, Henry Reiswig^9,14,15 een pionier in de toepassing van de rechtstreekse technieken om de verwijdering deeltjes te kwantificeren door reusachtige Caribbean sponzen, door afzonderlijk bemonstering van de water ingeademd en uitgeademd door de organismen in situ. Vanwege de moeilijkheid om Reiswig techniek toegepast bij kleinere suspensie feeders en meer uitdagende onderwater omstandigheden het grootste deel van het onderzoek op dit gebied was beperkt tot het laboratorium (in vitro) waarin de meeste indirecte technieken ¹⁶ incubatie. Yahel en collega's omgebouwd Reiswig directe in situ techniek om te werken in kleinere schaal omstandigheden. Hun methode, genaamd INEX ^16, is gebaseerd op de gelijktijdige onderwater bemonstering van het water ingeademd (In) en uitgeademd (Ex) van ongestoorde organismen. De verschillende concentratie van een middel (bijvoorbeeld bacteriën) tussen twee monsters (INEX) een maat voor de retentie (of productie) van die stof door het dier. De Inex techniek maakt gebruik van een open einde buizen enafhankelijk van de excurrent straal door de pompende werking van het onderzochte organisme passief vervangen vaarwater in de verzamelbuis. Terwijl Yahel en collega succesvol deze techniek toegepast bij het ​​onderzoek van meer dan 15 verschillende suspensie feeders taxa (bijvoorbeeld ^17), wordt de werkwijze beperkt door de hoge mate van oefening en ervaring nodig door de minuscule omvang van sommige excurrent openingen, en omstandigheden op zee.

Om deze obstakels te overwinnen, ontwikkelden we een alternatieve techniek gebaseerd op gecontroleerde zuiging van de bemonsterde water door minuut buizen (uitwendige diameter van <1,6 mm). Ons doel was om een eenvoudige, betrouwbare en goedkope apparaat dat schoon en gecontroleerd in situ water sampling uit een zeer specifiek punt, zou toelaten zoals de excurrent opening van bodemdieren schorsing feeders te creëren. Om effectief te zijn, heeft de werkwijze niet opdringerig zijn om te voorkomen dat de omgevingstemperatuur stromingsregiem beïnvloeden of wijzigen behavior van de bestudeerde organismen. Het apparaat hier gepresenteerd wordt genoemd VacuSIP. Het is een vereenvoudiging van het SIP is ontwikkeld door Yahel et al. (2007) ¹⁸ voor ROV-gebaseerde point sampling in de diepzee. De VacuSIP is aanzienlijk goedkoper dan de originele SIP en het is aangepast voor SCUBA-based werken. Het systeem is ontworpen volgens de principes gepresenteerd en getest door Wright en Stephens (1978) ¹⁹ en Møhlenberg en Riisgård (1978) ²⁰ voor het laboratorium instellingen.

Hoewel het VacuSIP systeem is ontworpen voor in situ studies van het metabolisme van benthische feeders suspensie kan ook worden gebruikt voor laboratoriumonderzoek en waar een gecontroleerde en schoon puntbronnen watermonster vereist. Het systeem is vooral handig wanneer de integratie gedurende langere perioden (min-uur) of in situ filtraties vereist. De VacuSIP is met succes gebruikt bij de Yahel lab sinds 2011, en ooktewerkgesteld in twee recente studies van nutriënten gemedieerd door het Caribisch gebied en de Middellandse Zee sponssoorten ²¹ (Morganti et al., ingediend).

Het gebruik van specifieke samplers, de verlengde bemonstering, en het veld omstandigheden, waarin VacuSIP wordt toegepast, leiden tot een aantal afwijkingen van de standaard oceanografische protocollen voor het verzamelen, filteren, en het opslaan van monsters voor gevoelige analyten. Om het risico van besmetting te verminderen door het VacuSIP systeem of het risico van wijziging van de bemonsterde water door bacteriële activiteit na inzameling, testten we diverse in situ procedures filtratie en opslag. Verschillende filterinrichtingen, opvangbakken en opslaan procedures om de meest geschikte techniek voor het analyseren van opgeloste anorganische (PO ₄ ^3- NO _x ^-, _NH4 ^+, SiO ₄₎ bereiken onderzocht en organische (DOC + DON) verbindingen, en ultra-plankton (<1081; m) en deeltjes organische (POC + PON) sampling. Om het risico van verontreiniging verder te verminderen, vooral onder veldomstandigheden, het aantal behandelingsstappen werd teruggebracht tot een minimum. De visueel formaat waarin de werkwijze wordt aangeboden is gericht op reproduceerbaarheid vergemakkelijken en de tijd die nodig is om de techniek efficiënt gehandeld.

Systeem overzicht

Monsters in situ gepompte water suspensie voeders met exhalant openingen van slechts 2 mm, wordt de pompactiviteit van elk monster eerst gevisualiseerd door het vrijgeven gefiltreerd fluoresceïne gekleurd zeewater naast de inhalatie-opening (en) en het observeren van de stroom vanaf de excurrent opening ¹⁶ (zie ook figuur 2B ^18). Het water in- en uitgeademde door de studie monster (incurrent en excurrent) worden dan gelijktijdig bemonsterd met behulp van een paar minuten buizen op maat gemaakte manipulator geïnstalleerd of twee van de "arms "van een omgekeerde flexibele draagbare driepoot (figuur 1 es aanvullende Video 1). Het water ingeademd door de studie organisme wordt verzameld door nauwkeurig positioneren van het proximale uiteinde van een buis in of nabij de inhalatie opening van het onderzoek organisme. Een identiek buis wordt dan gepositioneerd binnen het excurrent opening. voor deze functie moet goede zorg contact of verstoring van het dier, bijvoorbeeld door sediment resuspensie voorkomen. de bemonstering beginnen een duiker doorboort een septum in het verzamelvat met een injectienaald aan de distale uiteinde van elke buis, zodat de uitwendige waterdruk in de steekproef er water in het vat door de monsterbuis. de zuiging wordt geïnitieerd door het vacuüm reeds gemaakt in de flacons en het drukverschil tussen de uitwendige water en afgevoerd monsterhouder .

Om te zorgen voor een schone collectie van uitgeademde water en per ongeluk opzuigen van ambi voorkomenent water ^16, het water sampling rate heeft op een aanzienlijk lager tarief (<10%) dan de excurrent debiet te worden gehouden. De afzuiging wordt geregeld door de lengte van de buis en de inwendige diameter (ID). De kleine inwendige diameter zorgt ook voor een verwaarloosbaar dood volume (<200 pi per meter buis). Bemonstering gedurende langere tijd (minuten tot uren) kan de inherente patchiness van de meeste stoffen plaats integreren. Opdat voldoende monsters worden bewaard in langdurige onderwater bemonsteringen en voor vervoer naar het laboratorium, een in situ filtratie wordt aanbevolen voor gevoelige analyten. De selectie van de bemonstering schepen, filtratie assemblage, en slangen worden gedicteerd door de studie organismen en de specifieke onderzoeksvraag. De hieronder beschreven protocol veronderstelt dat een volledige metabolisch profiel van belang (voor een overzicht zie figuur 2). Echter, het modulaire karakter van het protocol maakt fof eenvoudige modificatie eenvoudiger of zelfs heel andere bemonsteringsschema's tegemoet te komen. Voor een volledige metabole profiel, moet de sampling protocol omvatten de volgende stappen: (1) Flow visualisatie; (2) Sampling ultra-plankton voeding (plankton <10 pm); (3) Steekproef anorganische voedingsstoffen opname en excretie (met behulp van in-line filters); (4) Sampling opgeloste organische opname en excretie (met behulp van in-line filters); (5) Particulate voeden en excretie (met behulp van in-line filters); (6) Herhaal stap 2 (ultra-plankton voeden als kwaliteitscontrole); (7) Flow visualisatie.

Wanneer het logistiek mogelijk is, verdient het aanbeveling het metabolische metingen worden gecombineerd met pompsnelheid (bijvoorbeeld de kleurstof voorkant snelheid werkwijze, ¹⁶⁾ en de ademhaling metingen. Deze metingen worden het best genomen bij het begin en einde van de sessiesteekproeven. Voor de ademhaling meten, onderwater optoden of micro-elektroden de voorkeur.

Protocol

1. voorbereidende stappen en Cleaning Procedures Reinigingsproduct Draag beschermende kleding, een laboratoriumjas en handschoenen te allen tijde. Uitvoeren van deze voorbereidende stappen in een schone ruimte vrij van stof en rook. Bereid een zoutzuur 5-10% zuur (HCl) met verse, kwalitatief hoogwaardige, dubbel gedestilleerd water. Bereid een 5% zeer goed oplosbaar basismengsel van anionogene en niet-ionogene oppervlakteactieve oplossing (zie Materials Lis…

Representative Results

Optimalisatie van zeewater collectie methoden Selectie van de collector flesjes en reiniging VacuSIP-compatibele opvangbakken zou een septum die het mogelijk maakt de bemonstering te worden geïnitieerd door piercing met een injectienaald te hebben. Ze moeten de verhoogde onderwater druk (2-3 bar bij typische scuba werkdiep…

Discussion

voorbereidende stappen

Collector flesjes voor DOM en nutriëntenanalyses

Sinds collector schepen kunnen interageren met opgeloste micro-bestanddelen en de sampler muren kan een substraat voor de groei van bacteriën ^30-34, verschillende flesjes voor DOM en voedingsstoffen collectie werden getest zijn. Borosilicate wordt niet aanbevolen voor silica kwantificering ^33,35, omdat glazen flessen de aanvan…

Materials

GorillaPod, Original	Joby	GP000001	flexible portable tripod
Flangeless Ferrule	IDEX Health & Science	P-200X	1/16" in Blue/pk
Male Nut	IDEX Health & Science	P-205X	1/16" in Green/10pk
Female to Female Luer	IDEX Health & Science	P-658
Female-Male Luer	IDEX Health & Science	P-655
Peek Tubing (250µm ID)	IDEX Health & Science	1531	1/16" OD x 0.01in ID x 5ft lenght. Alternative ID can be used
Two component resin epoxy	IVEGOR	9257	Mix well the two component resin before use
(TOC) EPA VIALS	Cole -Parmer	03756-20	40 ml glass vials. Manifactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09)
HDPE VIALS	Wheaton	986701 (E78620)	20 ml high-density polyethylene vials
Vacuette Z no additive	Greiner bio-one	455001	pre-vacuum by the manufacturer
Septum Sample Bottles	Thomas Scientific	1755C01	250 ml glass bottles
Septum Cap 1	Wheaton	W240844SP (E7865R)	22-400 for HDPE vials
Septum Cap 2	Wheaton	W240846 (1078-5553)	24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42)
In-line stainless steel Swinney Filter holders	Pall	516-9067	13mm of diameter
PTFE Seal Washer	Pall	516-8064	ring for stainless steel filter holders
TCLP Glass Filters	Pall	516-9126	binder-free glass fiber filters, 13mm of diameter,  pore size 0.7µm
Polycarbonate Filter Holders	Cole -Parmer	17295	13mm of diameter
Isopore Membrane Filters	Millipore	GTTP01300	13mm of diameter, pore size 0.2 µm
Contrad 2000 Solution	Decon Labs	E123FH	highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution
Sterile Syringe Filters	VWR International Eurolab S.L.	514-0061P	25mm of diameter , pore size 0.2 µm
Fluorescein	Sigma-Aldrich	(old ref.28802) 46955-100G	100g
Holdex, disposable,sterile	Greiner bio-one	450263	sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette
Sterile Needles	IcoGammaPlus	5160	0.7mm x 30mm
Cryovials Nalgene	Nalgene	V5007(Cat. No.5000-0020)	2ml
Cryobox carton	Rubilabor	M-600	145x145x55mm p/microtube 1.5 ml
Orthophosphoric Acid	Sigma	79617
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	500g
Glutaraldehyde	Merck	8,206,031,000	25%, 1 L
Hand Vacuum Pump	Bürkle	5620-2181