Laser à thulium à ondes continues pour le chauffage des cellules cultivées pour enquêter sur les effets thermiques cellulaires
Summary
Une configuration expérimentale originale pour le chauffage des cellules dans un plat de culture utilisant un rayonnement laser à onde continue de 1,94 μm est présentée ici. En utilisant cette méthode, les réponses biologiques des cellules épithéliales du pigment rétinien (RPE) après différentes expositions thermiques peuvent être étudiées.
Abstract
Une méthode originale pour chauffer des cellules cultivées à l'aide d'un laser à thulium à ondes continues de 1,94 μm pour une évaluation biologique est présentée ici. Le rayonnement laser Thulium est fortement absorbé par l'eau, et les cellules au fond du plat de culture sont chauffées par diffusion thermique. Une fibre laser avec un diamètre de 365 μm est réglée à environ 12 cm au-dessus du plat de culture, sans aucune optique, de sorte que le diamètre du faisceau laser soit presque équivalent au diamètre intérieur du plat de culture (30 mm). En conservant une quantité constante de milieu de culture dans chaque expérience, il est possible d'irradier les cellules avec une augmentation de température hautement reproductible.
Pour étalonner l'augmentation de la température et sa distribution dans un plat de culture cellulaire pour chaque réglage de puissance, la température a été mesurée pendant 10 s d'irradiation à différentes positions et au niveau cellulaire. La distribution de la température a été représentée à l'aide d'un logiciel graphique mathématiqueProgramme, et son modèle à travers le plat de la culture était sous forme gaussienne. Après l'irradiation au laser, différentes expériences biologiques pourraient être effectuées pour évaluer les réponses cellulaires dépendantes de la température. Dans ce manuscrit, la coloration de la viabilité ( c'est-à-dire la distinction des cellules vivantes, apoptotiques et mortes) est introduite pour déterminer les températures de seuil pour l'apoptose cellulaire et la mort après différents moments.
Les avantages de cette méthode sont la précision de la température et du temps de chauffage, ainsi que son efficacité élevée dans les cellules de chauffage dans un plat de culture de cellules entières. En outre, il permet d'étudier avec une grande variété de températures et de durées de temps, qui peuvent être bien contrôlés par un système d'exploitation informatisé.
Introduction
Comprendre les réponses biologiques cellulaires dépendantes de la température est d'une grande importance pour les traitements hyperthermia réussis. La photocoagulation au laser rétinienne avec un laser thermique, utilisé en ophtalmologie, est l'un des traitements laser les plus établis en médecine. La lumière visible, principalement de la longueur d'onde verte à jaune, est utilisée dans le traitement au laser de la rétine. La lumière est fortement absorbée par la mélanine dans les cellules épithéliales du pigment rétinien (RPE), qui forment la monocouche cellulaire la plus externe de la rétine. Les médecins et les chercheurs s'intéressent récemment à une irradiation thermique très douce (photocoagulation sous-visible) comme nouvelle stratégie thérapeutique pour différents types de troubles rétiniens 1 , 2 . À la suite de cette tendance, notre intérêt est de subalternément chauffer les cellules RPE sous un contrôle précis de la température, une technique appelée traitement photothermique à température contrôlée (TC-PTT).
Option récenteLa technologie acoustique de notre institut a permis la mesure en temps réel des augmentations de température dans les sites irradiés de la rétine. Cela permet de contrôler l'augmentation de la température pendant l'irradiation 3 . Cependant, étant donné que l'hyperthermie sous-létale sur la rétine, causée par le chauffage de cellules RPE sous-létalement, n'a pas été considérée auparavant en raison de l'impossibilité de mesurer et de contrôler la température, les réponses cellulaires dépendant de la température des cellules RPE suite à une irradiation laser thermique Ont été étudiés très peu à ce jour. En outre, non seulement la différence de température n'a pas été discutée en détail, mais aussi la différence dans le comportement cellulaire des cellules survivantes après une irradiation sub-létale et mortelle. Par conséquent, pour recueillir des preuves scientifiques sur les traitements basés sur TC-PTT, nous cherchons à élucider les réponses biologiques des cellules RPE dépendantes de la température et leurs mécanismes en utilisant des configurations expérimentales in vitro .
Pour tIl est nécessaire d'établir une installation de chauffage cellulaire répondant aux conditions suivantes: 1) une possibilité pour une augmentation rapide de la température, 2) un temps et une température précisément contrôlés, et 3) un nombre relativement élevé de cellules examinées pour des expériences biologiques . En ce qui concerne la méthode de chauffage, un laser clinique, tel qu'un laser Nd.YAG à fréquence double (532 nm), n'est malheureusement pas adapté au chauffage de la culture cellulaire. Ceci est dû au nombre fortement réduit de mélanosomes dans les cellules RPE cultivées. L'absorption de la lumière laser peut être inhomogène, et la température augmente au niveau cellulaire est variable entre les expériences, même lorsqu'elles sont irradiées avec une même puissance de rayonnement. Plusieurs études précédentes ont rapporté l'utilisation de papier noir sous le fond du plat pendant l'irradiation 4 ou l'utilisation de mélanosomes supplémentaires qui sont phagocytisés par les cellules de culture avant les expériences 5 , 6 . Un grand nombre deLes études biologiques in vitro pour évaluer les réponses cellulaires induites par l'hyperthermie ont été effectuées à l'aide d'une plaque chauffante, d'un bain-marie ou d'un incubateur de CO 2 avec un réglage de température 7 . Ces méthodes nécessitent une longue période de chauffage car cela prend du temps ( c'est-à-dire plusieurs minutes) pour atteindre la température souhaitée. En outre, en utilisant ces méthodes, il est difficile d'obtenir un historique thermique détaillé ( c'est-à-dire une température multipliée par le temps) au niveau cellulaire. En outre, la température entre les cellules à différentes positions dans un plat de culture peut différer en raison de la diffusion variable de la température. Dans la plupart des cas, cette information de température temporelle et spatiale pendant l'hyperthermie n'a pas été prise en considération pour les analyses biologiques, même si la réponse biologique des cellules peut être affectée de manière critique par la température et la durée de la température augmentée.
Pour surmonter ces problèmes, un contiLe laser à thulium à ondes nuous a été utilisé ici pour chauffer les cellules. Le rayonnement laser Thulium (λ = 1,94 μm) est fortement absorbé par l'eau 8 et les cellules au fond du plat de culture sont stimulées thermiquement uniquement par diffusion thermique. La fibre laser avec un diamètre de 365 μm est réglée à environ 12 cm au-dessus du plat de culture, sans aucune optique entre les deux. Le diamètre du faisceau laser diverge de sorte qu'il soit presque équivalent au diamètre intérieur du plat de culture (30 mm) à la surface du milieu de culture. Avec une quantité constante de milieu de culture, il est possible d'irradier les cellules avec l'augmentation de température De haute répétabilité. Les réglages de puissance variables permettent une irradiation jusqu'à 20 W, et la température moyenne au niveau cellulaire peut être augmentée jusqu'à ΔT ≈ 26 ° C en 10 s.
En modifiant les conditions d'irradiation, il est également possible de modifier le profil du faisceau laser pour faire varier la distribution de la températureDans un plat culturel. Par exemple, il est possible d'étudier avec une répartition de la température Gaussienne, comme dans l'étude actuelle, ou avec une répartition homogène de la température. Ce dernier peut être avantageux pour étudier les effets des réponses cellulaires dépendantes de la température plus spécifiquement pour les augmentations de la température sous-létales, mais pas pour le stress de la mort cellulaire ou les réponses de guérison des plaies.
Au total, l'irradiation au laser Thulium peut permettre d'étudier différents types de facteurs biologiques, tels que l'expression génétique / protéique, la cinétique de la mort cellulaire, la prolifération cellulaire et le développement de la fonctionnalité cellulaire, après différentes expositions thermiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
En discutant des réponses cellulaires biologiques liées à la température, non seulement la température, mais aussi la durée de la température augmentée, est importante, car la plupart des processus biochimiques dépendent du temps. En particulier dans le domaine de l'hyperthermie induite par laser dans l'ophtalmologie, en raison de la courte période, de millisecondes à secondes, il est difficile d'étudier les effets thermiques cellulaires avec un contrôle précis de la température. Par conséque…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche du ministère fédéral de l'Éducation et de la Recherche (BMBF) (subvention N ° 13GW0043C) et d'un Bureau européen de recherche et de développement aérospatiaux (EOARD, numéro de dossier FA9550-15-1-0443)
Materials
| Reagents | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | Add (2)-(4) before use. Warm in 37°C water bath before use. |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955-100ML | Containing 10000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 μg Amphotericin B in 1ml. Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use. |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636-100ML | Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use (final concentration: 1 mM) |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C-500ML | Add 50 ml in 500 ml medium bottole (1) before use (final: 10%) |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-25G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Human VEGF Quantikine ELISA Kit | R&D System | DVE00 | |
| Oxiselect Total Glutathione Assay Kit | Cell Biolabs, Inc | STA-312 | |
| Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit | PromoKine | PK-CA707-30018 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Thulium laser | Starmedtec GmbH | Prototype | 0-20 W |
| 365 mm core diameter fiber | LASER COMPONENTS Germany | CF01493-52 | |
| Thermocouple | Omega Engineering Inc | HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M | |
| Heating plate | MEDAX | ||
| Microplate reader (spectrofluorometer) | Molecular Device | Spectramax M4 | |
| cell homogenizer | QIAGEN | TissueLyser LT | |
| Fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ti | |
| mathematical software program | The Mathworks. Inc | MATLAB Release 2015b | |
| system-design platform | National Instrument | Labview | Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench |
Referencias
- Inagaki, K., et al. Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema. Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).
- Roider, J., et al. Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).
- Brinkmann, R., et al. Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients. J Biomed Opt. 17 (6), 061219 (2012).
- Yoshimura, N., et al. Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).
- Denton, M. L., et al. Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).
- Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization. Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).
- Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells. Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).
- Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation. Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).
- Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress. Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).
- Denton, M. L., et al. Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage. J Biomed Optics. 16 (3), (2011).
- Morgan, C. M., Schatz, H. Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation. Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).
