עמית תרבות Microbiome חי עם Microengineered אדם המעיים villi בתוך גוט-על-שבב מכשיר microfluidic
Summary
אנו מתארים פרוטוקול במבחנה Microbiome במעיים שיתוף תרבות villi מעיים במשך תקופה ארוכה באמצעות אדם בטן-על-שבב מערכת microphysiological.
Abstract
כאן אנו מתארים פרוטוקול לבצע לטווח ארוך שיתוף התרבות של Microbiome במעיים רב המין האנושי עם villi המעי microengineered בתוך האדם בטן-על-שבב מכשיר microphysiological. אנחנו לשחזר את ממשק רקמות לומן-נימי המעי במכשיר microfluidic, שבו דפורמציות מכני פיזיולוגיים זרימת גזירה נוזל מוחלים כל הזמן לחקות תנועה פריסטלטית. ב microchannel לומן, האפיתל במעי האדם תאים קאקו-2 הם מתורבתים לגבש האפיתל סיסי 'נבט חינם' ו להתחדש villi המעי הדק. תאי חיידקים טרום בתרבית הם מחוסנים לתוך צד לומן להקים מערכת אקולוגי מארח חיידק. אחרי תאי חיידקים לדבוק למשטח הפסגה של villi, זרימת נוזל דפורמציות מכאניים יתחדשו לייצר microenvironment יציב שבו מדיום תרבות הטריה מסופק כל זמן וחיידקים מאוגדים (כמו גם פסולי חיידקים) יוסרו באופן רציף. לאחר שיתוף התרבות המורחבת from ימים עד שבועות, microcolonies המרובה הם מצאו להיות ממוקמים באופן אקראי בין villi, ושניהם חיידקים ותאים אפיתל להישאר קיימא ופונקציונליים עבור שבוע אחד לפחות בתרבות. פרוטוקול שיתוף תרבות שלנו ניתן להתאים לספק פלטפורמה תכליתי עבור מערכות אקולוגיות מאכסן Microbiome אחרים שניתן למצוא באיברים אנושיים שונים, אשר עשוי להקל במחקר במבחנה של תפקיד Microbiome האדם מנצח בבריאות ובחולי.
Introduction
מעי האדם מטפח מערך מגוון מדהים של מינים של חיידקים (<1,000 מינים) ומספר עצום של תאי מיקרוביאליים (10 פעמים יותר מאשר תאי מארחי האדם) וגנים (100 פעמים יותר מאשר הגנום האנושי) 1. Microbiomes אדם אלה ממלא תפקיד מרכזי בחילוף חומרים מזינים xenobiotics, ויסות מערכת חיסונית, ושמירת הומאוסטזיס 2 מעיים. באופן לא מפתיע, בהתחשב פונקציות מגוונות אלה, Microbiome הבטן commensal בהרחבה מודולציה בבריאות ובחולי 3. לכן, להבנת תפקידו של Microbiome במעי אינטראקציות בין מאכסן חיידק הם בעלי חשיבות רבה לקדם עיכול (GI) בריאות ולחקור רפויים חדש לטיפול בבעיות מעיים 4. עם זאת, קיימים מודלים המעי במבחנה (למשל, תרבויות סטטי) להגביל מאכסן Microbiome שיתוף תרבות לתקופה קצרה של זמן (<1 יום) כי תאי חיידקים לגדול יותר ופשרה מחסום המעייםפונקציה 5. במודלים של בעלי חיים סרוגייט (למשל, נבט חינם 6 או מהונדסים גנטית עכברים 7) הם גם לא נפוץ ללמוד crosstalk Microbiome מארח-בטן משום קולוניזציה ותחזוקה יציבה של Microbiome מעי אנושי קשה.
כדי להתגבר על אתגרים אלה, פיתחנו האדם biomimetic לאחרונה "גוט-על-שבב" מערכת microphysiological (איור 1 א, משמאל) לחקות את האינטראקציות Microbiome מארח-gut המתרחשות במעי האדם החיים 5,8. במעיים-על-שבב microdevice מכיל שני ערוצים microfluidic במקביל מופרד על ידי מטריקס גמיש, נקבובי, תאי (ECM) קרום מצופה צופה על ידי תאים אנושי מעי אפיתל קאקו-2, חיקוי ממשק רקמות לומן-נימי המעיים (איור 1A 9, מימין). אבק מונחה דפורמציות קצבית מחזורית לגרום דפורמציות מכאניות פיסיולוגיות המחקות שינויים בדרך כלל inducאד על ידי תנועה פריסטלטית (איור 1 א, ימין). מעניין, כאשר תאי קאקו-2 גדלים בתוך מעי-על-שבב עבור יותר מ -100 שעות, הם יוצרים באופן ספונטני תלת ממדי (3D) villi מעי עם צומת הדוקים, גבולות מברשת פסגה, תאי שגשוג מוגבלים מאורות הבזליים, ייצור ליחה, פעילות חילוף חומרים סמים מוגברת (למשל, ציטוכרום P450 3A4, CYP3A4), וגלוקוז משופרת reuptake 8. ב microenvironment 'נבט חינם' זה, אפשר היה לשתף תרבות הגנרלגוברנמן רמנוסוס לקטובצילוס פרוביוטי או במערך הטיפולי של תערובת חיידקים פרוביוטיים עם תאי אפיתל המארח עד שבועיים 5,10.
במחקר זה, אנו מתארים את הפרוטוקול המפורט לביצוע Microbiome מארח-gut שיתוף תרבות במעיים-על-שבב במכשיר במשך תקופה ארוכה. בנוסף, אנו דנים בנושאים קריטיים ואתגרים פוטנציאל להיחשב עבור יישום רחב של p תרבות שיתוף מאכסן Microbiome זהrotocol.
Protocol
Representative Results
Discussion
הבנת יחסי גומלין בין מאכסן Microbiome היא קריטית לקידום רפואה; עם זאת, מודלי תרבית תאים מסורתיים מתבצעים צלחת פלסטיק או צלחת היטב סטטי אינם תומכים שיתוף התרבות היציבה של תאי מעי אדם עם חי חיידקים במעי במשך יותר מ 1-2 ימים, כי תא חיידקים בעיקר לגדול יותר התאים היונקים במבחנ…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sri Kosuri (Wyss Institute at Harvard University) for providing the GFP-labeled E. coli strain. This work was supported by the Defense Advanced Research Projects Agency under Cooperative Agreement Number W911NF-12-2-0036, Food and Drug Administration under contract #HHSF223201310079C, and the Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard University. The views and conclusions contained in this document are those of the authors and should not be interpreted as representing the official policies, either expressed or implied, of the Army Research Office, Army Research Laboratory, Food and Drug Administration, or the U.S. Government. The U.S. Government is authorized to reproduce and distribute reprints for Government purposes notwithstanding any copyright notation hereon.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37°C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121°C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Trypsin/EDTA solution (0.05%) | Gibco | 25300-054 | Warm it up at 37℃ in a water bath. |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/mL) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 mL disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25G5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
Referencias
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- Tremaroli, V., Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489, 242-249 (2012).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. Gut Microbiota in Health and Disease. Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).
- Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).
- Garrett, W. S., et al. Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system. Cell. 131, 33-45 (2007).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).
- Huh, D., Kim, H. J., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).
- Miller, W. G., Lindow, S. E. An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions. Gene. 191, 149-153 (1997).
- Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15, 745-752 (2015).
- Lentle, R. G., Janssen, P. W. Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review. J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).
- Granato, D., et al. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).
- Dewhirst, F. E., et al. The human oral microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Hay, P. E., et al. Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage. Br Med J. 308, 295-298 (1994).
